CD14啟動(dòng)子-159位點(diǎn)基因多態(tài)性與中國(guó)朝鮮族2型糖尿病足患者足背動(dòng)脈硬化相關(guān)性研究

Amit Sinha 金香子 于婕 鄭壽煥 金光明

[摘要] 目的 研究CD14基因-159位點(diǎn)基因多態(tài)性與中國(guó)朝鮮族2型糖尿病足患者（DF）足背動(dòng)脈硬化（FDA）的關(guān)聯(lián)性。 方法 選取2018年10月至2020年5月在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科及手足外科住院的朝鮮族DF患者286例，彩色多普勒超聲觀察患者FDA情況，將存在FDA的患者分為無(wú)潰瘍組（NFDAU組）和有潰瘍組（FDAU組），記錄全部2型糖尿?。═ype 2 diabetic mellitus，T2DM）患者血液生化指標(biāo)。同時(shí)，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)對(duì)所有DF患者的CD14基因-159位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。 結(jié)果 無(wú)潰瘍組和有潰瘍組CD14基因-159位點(diǎn)上，各基因型及等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.801，P>0.05;χ2=1.864，P>0.05）;CC基因與CT及TT基因基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.009，P<0.05）;NFDAU組和FDAU組在病程、吸煙飲酒、高血糖及高尿酸指標(biāo)方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Logistic回歸分析顯示，病程、吸煙飲酒及C等位基因均與FDAU相關(guān)聯(lián)（P<0.05）。 結(jié)論 CD14基因-159位點(diǎn)基因多態(tài)性與中國(guó)朝鮮族DF并發(fā)FDA相關(guān)，其中CC純合子基因是DF患者并發(fā)FDAU的遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因素。病程、吸煙、飲酒及C等位基因是FDAU的危險(xiǎn)因素。

[關(guān)鍵詞] CD14基因-159位點(diǎn);基因多態(tài)性;2型糖尿病足;足背動(dòng)脈硬化;潰瘍;彩色多普勒超聲

[中圖分類號(hào)] R575.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）33-0006-05

[Abstract] Objective To study the association between gene polymorphism of -159 locus in CD14 gene promoter and foot dorsal arteriosclerosis （FDA） in Chinese Korean type 2 diabetic foot patients （DF）. Methods A total of 286 Korean DF patients hospitalized in the Department of Endocrinology and Department of Hand and Foot Surgery in Yanbian University Hospital from October 2018 to May 2020 were selected. The FDA status of the patients was observed using color Doppler ultrasound. The patients with FDA were classified as the non-ulcer group（NFDAU） and the ulcer group （FDAU）. All biochemical blood indicators of type 2 diabetic mellitus （T2DM） patients were recorded. At the same time， the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism technique was used to perform genotype analysis on the-159 locus of CD14 gene in all DF patients. Results There was no statistically significant difference in the genotypes and allele frequencies at-159 locus of CD14 gene between the non-ulcer group（NFDAU） and the ulcer group （FDAU） （χ2=1.801， P>0.05; χ2=1.864， P>0.05）. The gene frequency difference between CC， CT and TT genes was statistically significant （χ2=0.009， P<0.05）.There were significant differences in disease course， smoking and drinking， hyperglycemia，and hyperuric acid indicators between NFDAU and FDAU（P<0.05）.Logistic regression analysis showed that the course of disease， smoking and drinking， and C allele were all associated with FDAU（P<0.05）. Conclusion The polymorphism of 159 locus of CD14 gene is associated with FDA in Chinese Koreans with DF. The CC homozygous gene is a genetic risk factor for DF patients with FDAU. The course of disease， smoking， drinking and C allele are risk factors for FDAU.

[Key words] 159 Locus in CD14 gene; Gene polymorphism; Type 2 diabetic foot; Foot dorsal arteriosclerosis; Ulcer; Color Doppler ultrasound

糖尿病足（Diabetic feet，DF）是糖尿病所有并發(fā)癥中最為嚴(yán)重、兇險(xiǎn)的類型，可引起患者截肢、殘疾，重者可導(dǎo)致下肢壞疽、感染、甚至病死。DF包括以下兩個(gè)階段，即糖尿病周圍神經(jīng)病變（Diabetic peripheral neuropathy，DPN）及足背動(dòng)脈硬化（Foot dorsal arteriosclerosis，F(xiàn)DA），兩者相互關(guān)聯(lián)、互相演進(jìn)，直接導(dǎo)致患者生存質(zhì)量嚴(yán)重下降，并威脅患者生命。然而，目前臨床對(duì)其尚缺乏有效的治療手段。因此，越來(lái)越多的觀點(diǎn)認(rèn)為在DF發(fā)病前采取早期干預(yù)和治療意義重大[1]。多年來(lái)，本課題組一直從事CD14基因-159位點(diǎn)基因多態(tài)性與2型糖尿?。═ype 2 diabetic mellitus，T2DM）患者血管病變相關(guān)性的研究，本研究發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與T2DM患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、左心室肥厚密切相關(guān)，且-159位點(diǎn)的基因突變可引起T2DM患者微血管血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈、腎動(dòng)脈發(fā)生一系列病變[2-4]，但目前國(guó)際和國(guó)內(nèi)關(guān)于其與足背動(dòng)脈硬化關(guān)聯(lián)的研究較少，這也為本研究提供了進(jìn)一步研究的空間和思路。

邊疆少數(shù)民族人民的身體健康一直是黨和國(guó)家關(guān)心的重要問(wèn)題，在地域和風(fēng)俗因素影響下，朝鮮族人民具有喜飲酒、喜高鹽飲食等習(xí)慣，而以上均被認(rèn)為是糖尿病血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素。為此，筆者進(jìn)行了本研究，旨在為邊疆地區(qū)朝鮮族DF患者提供一些發(fā)病危險(xiǎn)因素及臨床預(yù)警信息，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月至2020年5月在我院內(nèi)分泌科及手足外科住院的朝鮮族DF患者286例，所有患者均為T(mén)2DM患者，T2DM診斷根據(jù)2019年WHO公布的最新診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。并排除具有如下任一種情況者：繼發(fā)性高血壓、冠心病、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及因藥物導(dǎo)致的肝腎功能異常。其中男168例，女118例，平均年齡（54.23±9.68）歲。需要指出的是，本研究意在從早期對(duì)DF患者進(jìn)行預(yù)防，因此篩選的患者只包含Wagner分級(jí)[6]中的0～3級(jí)患者，嚴(yán)重的合并周圍神經(jīng)病變的患者未納入其中。所采用糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①符合糖尿病診斷;②具有下肢缺血的臨床表現(xiàn)，具體表現(xiàn)為下肢皮溫下降、皮膚蒼白、伴有麻木酸痛感及出現(xiàn)間歇性跛行癥狀;③彩色多普勒超聲檢測(cè)出現(xiàn)足背動(dòng)脈斑塊形成、管腔狹窄甚至閉塞。最終篩選出FDA患者244例，其中無(wú)潰瘍組（Non-foot dorsal arteriosclerosis ulcer，NFDAU）患者184例，有潰瘍組（Foot dorsal arteriosclerosis ulcer，F(xiàn)DAU）患者60例。本研究經(jīng)延邊大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參加研究的患者均簽署知情同意書(shū)并知曉研究?jī)?nèi)容。

1.2 方法

1.2.1 臨床指標(biāo)? 所有患者年齡、性別、吸煙及飲酒等自然信息，根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)化建議，吸煙人群的定義標(biāo)準(zhǔn)為“每周吸煙>4次，總量≥6支”;飲酒人群的定義標(biāo)準(zhǔn)為“平均攝入酒精量>30 g/d，持續(xù)時(shí)間≥半年”[7]。測(cè)量血壓、病程、身體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI），抽取肘靜脈血進(jìn)行生化檢測(cè)，項(xiàng)目含空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、三酰甘油（Triglyceddes，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、C-反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、糖化血紅蛋白（Glycatized hemoglobin，HbAlc）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）、尿酸（Uric acid，UA）等。

1.2.2 彩色多普勒超聲檢查足背動(dòng)脈? 患者行彩色多普勒超聲檢查前禁煙及禁酒48 h，采用坐位檢查，使用東芝S2000彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭頻率為5～7.5 MHz，觸及足背動(dòng)脈搏動(dòng)感時(shí)，將探頭沿血管走行縱切探查，不要用力壓迫血管，測(cè)量足背動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（Intima-media thickness，IMT），當(dāng)IMT≥1 mm時(shí)可診斷為DFA[8]。

1.3 患者DNA的提取

根據(jù)WizardR Genomic DNA Purification Kit （Pro-mega公司）說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA。上游引物為：5-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3，下游引物為：5-GTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3。擴(kuò)增完成后，以Ava Ⅱ限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，之后進(jìn)行電泳，在2%瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)基因條帶后進(jìn)行基因型的判讀，記錄所有患者基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，評(píng)估等位基因及基因頻率利用χ2檢驗(yàn)。Logistic回歸分析評(píng)價(jià)各風(fēng)險(xiǎn)因素及C、T等位基因突變與FDAU的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 彩色多普勒超聲檢查FDA聲像圖

根據(jù)彩超聲像圖（圖1A）中，可見(jiàn)足背動(dòng)脈前壁上多個(gè)強(qiáng)回聲斑塊形成，但動(dòng)脈管腔未見(jiàn)狹窄，血流通暢;圖1B可見(jiàn)足背動(dòng)脈后壁上弱回聲斑塊形成，造成此處動(dòng)脈管腔狹窄，血流束變細(xì);圖1C可見(jiàn)足背內(nèi)部充滿弱回聲，管腔內(nèi)未見(jiàn)血流信號(hào)，提示足背動(dòng)脈閉塞。

2.2 CD14基因-159位點(diǎn)基基因型測(cè)序

經(jīng)檢驗(yàn)，CD14基因-159位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，等位基因頻率在不同種族人群中的分布亦符合Hardy-Weinberg平衡定律。見(jiàn)圖2。

2.3 CD14基因-159位點(diǎn)基因型

CD14 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后基因型有3種，CC型（497 bp），CT型（497、353、l44 bp），TT型（353、144 bp）。見(jiàn)圖3。

2.4 NFDAU組和FDAU組CD14基因-159位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

根據(jù)彩超結(jié)果及肉眼觀察患者足背表皮情況，將DF患者分為有潰瘍組（FDAU組）和無(wú)潰瘍組（NFDAU組）。CD14基因-159位點(diǎn)基因多態(tài)性在朝鮮族正常對(duì)照組和朝鮮族DN患者中的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.801，P>0.05）;等位基因頻率在兩組人群中的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.864，P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.5 NFDAU組和FDAU組CD14基因-159位點(diǎn)CT+TT基因型和CC基因頻率比較

將CD14-159位點(diǎn)CC純合子與CT雜合子+TT純合子基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.009，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.6 自然信息與臨床生化指標(biāo)的比較

FDAU組與NFDAU組年齡、吸煙、飲酒、病程、FBG、HbAlc和CRP比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其余各項(xiàng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

2.7 FDAU危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

將FDA患者視為一個(gè)隊(duì)列人群，以發(fā)生FDAU與否為因變量，將所有臨床資料和生化指標(biāo)以及是否存在C-1591T突變?yōu)樽宰兞浚M(jìn)行Logistic回歸分析。病程、吸煙和飲酒是FDAU的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而C等位基因突變是FDAU的風(fēng)險(xiǎn)因素，存在C突變的DF患者合并FDAU風(fēng)險(xiǎn)增高。見(jiàn)表4。

3 討論

襲龍祥等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，約1/6的T2DM患者最終會(huì)發(fā)生DF，DF發(fā)病的典型“三聯(lián)征”包括神經(jīng)異常、動(dòng)脈異常及肌肉攣縮，而三者中最主要的病因就是足背動(dòng)脈硬化（FDA）引發(fā)的動(dòng)脈管腔狹窄及堵塞，導(dǎo)致足部局部組織缺血缺氧，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，一旦發(fā)生感染，后果極為嚴(yán)重，甚至?xí)l(fā)展成為壞疽[10-11]。

T2DM患者一般首先出現(xiàn)雙下肢深動(dòng)脈及淺動(dòng)脈血管的缺血性病變，當(dāng)病變發(fā)展到一定程度時(shí)，則會(huì)累及足部，發(fā)生缺血性潰瘍，即糖尿病足潰瘍（FDAU），由于足部動(dòng)脈位于人體供血末端，因此具有反復(fù)發(fā)作、難以愈合、遷延不愈等特點(diǎn)。本課題組前期研究顯示，CD14基因-159位點(diǎn)基因多態(tài)性與中國(guó)朝鮮族T2DM患者下肢動(dòng)脈硬化相關(guān)，其機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)：CD14主要表達(dá)在單核巨噬細(xì)胞表面，通過(guò)刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（Mononuclearphagocyte system，MPS）釋放多種炎癥細(xì)胞因子，加速蛋白質(zhì)糖化產(chǎn)物的形成，并導(dǎo)致其在血管內(nèi)堆積，引起血管平滑肌細(xì)胞增生和內(nèi)中膜增厚;其次通過(guò)合成膠原蛋白Ⅲ[12]或直接作用于管壁細(xì)胞，增加血管細(xì)胞外基質(zhì)，引起纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，使內(nèi)中膜增厚、血栓形成，最終導(dǎo)致動(dòng)脈硬化及硬化斑塊的形成[13]，而足背動(dòng)脈是下肢動(dòng)脈在足部的延續(xù)，因此該基因多態(tài)性與DFAU的關(guān)系不難理解。

國(guó)內(nèi)一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，感覺(jué)神經(jīng)肽物質(zhì)（Substance P，SP）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）與FDAU的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[14]。Park等[15]利用SP對(duì)糖尿病大鼠FDAU模型進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)，潰瘍面的愈合效果有明顯提升。而本研究的CD14基因-159位點(diǎn)C-T的基因突變過(guò)程中，引起組氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼岬淖兓?，此過(guò)程會(huì)導(dǎo)致SP和VEGF表達(dá)大幅降低，最終可導(dǎo)致潰瘍面的愈合不良，因此反向證明此基因突變與FDAU的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮（Nitricoxide，NO）在整個(gè)炎癥潰瘍的發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)過(guò)程中，均發(fā)揮著重要作用[16]。CD14基因-159位點(diǎn)基因突變后會(huì)降低氧化酶的活性，導(dǎo)致動(dòng)脈血管細(xì)胞的凋亡、一氧化氮（NO）的合成減少及各種炎癥因子大量釋放[17]，而FDAU究其根本是一種炎癥反應(yīng)，因此兩者之間必然存在著較為密切的關(guān)聯(lián)性。

有關(guān)年齡、病程、FBG和HbAlc與FDAU存在相關(guān)性的機(jī)制比較容易理解，T2DM病程長(zhǎng)者，其難以控制的高血糖及糖代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advancd glyca-sylation end products，AGEs）在血管中大量蓄積，可引起皮膚、皮下組織及血管的多種損害;另外，持續(xù)的高糖狀態(tài)為細(xì)菌提供了在皮膚創(chuàng)面大量滋生、繁殖的溫床，以上均可引起局部的感染破潰、甚至壞疽[18]。

除了病理生理方面的原因，種族文化、生存地域、生活習(xí)慣的不同也越來(lái)越被認(rèn)為是T2DM發(fā)病的重要病因，我國(guó)的朝鮮族主要聚集在我國(guó)東北部，民俗開(kāi)朗、能歌善舞，有著悠久的飲酒傳統(tǒng)，甚至形成了一種“飲酒文化”。朝鮮族的飲酒文化可以說(shuō)是深入到百姓的日常生活當(dāng)中，是朝鮮族在適應(yīng)東北地區(qū)寒冷生態(tài)環(huán)境，克服困難，憧憬美好生活的一種樂(lè)觀精神的反映。曾有調(diào)查研究顯示，朝鮮族人均每日酒精攝入量達(dá)到70～80 g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)際上推薦的不超過(guò)30 g的標(biāo)準(zhǔn)。酒類中D-氨基酸（D-amino acids，DAA）代謝會(huì)導(dǎo)致尿酸大量生成，高尿酸血癥可引發(fā)炎癥遞質(zhì)釋放、動(dòng)脈脂質(zhì)過(guò)氧化而引起動(dòng)脈硬化[19]。此外，朝鮮族在飲酒時(shí)，喜歡佐食高鹽、高糖食物，因而DF的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯上升。煙草中的尼古丁、焦油吸收到人體后，其產(chǎn)生的氧自由基等物質(zhì)進(jìn)入血管可導(dǎo)致血管壁彈性下降，最終導(dǎo)致動(dòng)脈硬化及DF等疾病的發(fā)生[20-21]。

綜上所述，筆者認(rèn)為CD14基因-159位點(diǎn)基因多態(tài)性與中國(guó)朝鮮族FDAU患者存在相關(guān)性，其純合子CC基因性可能是FDAU獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。年齡、病程、FBG、CRP和HbA1c均可被視為FDAU發(fā)病的危險(xiǎn)因素。希望通過(guò)本研究可指導(dǎo)糖尿病患者早期預(yù)防DF的發(fā)生，并為患者從基因水平篩查DF提供更好的依據(jù)。

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（收稿日期：2021-03-17）