gsdmd基因敲除巨噬細(xì)胞RAW 264.7的構(gòu)建：基于CRISPRR/Cas9系統(tǒng)

周麗婷，葉 穎，原海波，吳超逸，吳淑燕

1蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，江蘇 蘇州 215123；2蘇州大學(xué)劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇 蘇州 215123

巨噬細(xì)胞是機(jī)體組織微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞，具有吞噬、抗原加工與遞呈、免疫調(diào)節(jié)等生理功能，在自身免疫性疾病、感染、炎癥和腫瘤等疾病中具有關(guān)鍵作用［1-3］。巨噬細(xì)胞表面模式識(shí)別受體可識(shí)別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式等，從而引起細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)瀑布，介導(dǎo)免疫反應(yīng)，維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)［4-5］。因此，巨噬細(xì)胞作為工具細(xì)胞在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

沙門菌作為兼性胞內(nèi)菌，經(jīng)腸上皮細(xì)胞進(jìn)入固有層繁殖擴(kuò)散引發(fā)疾病。機(jī)體固有免疫是對(duì)抗入侵病原微生物的第一道防線，其中巨噬細(xì)胞可通過(guò)被動(dòng)或主動(dòng)吞噬的方式捕獲沙門菌［6］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可通過(guò)凋亡、自噬和焦亡等多種程序性細(xì)胞死亡方式，暴露細(xì)菌使其被中性粒細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞“二次清除”［7-8］。細(xì)胞焦亡是一種程序性炎性細(xì)胞死亡方式，與Gasdermin家族蛋白密切相關(guān)，近年來(lái)在抗感染免疫應(yīng)答研究領(lǐng)域備受關(guān)注，其中g(shù)asdermin D（GSDMD）是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白［9-10］。目前關(guān)于GSDMD參與抗感染免疫調(diào)控細(xì)胞生死命運(yùn)的具體機(jī)制尚未完全明了，所以構(gòu)建敲除gsdmd基因的細(xì)胞或動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究GSDMD的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。然而目前為止暫未有成熟的抑制劑用于GSDMD功能的研究，RNA干擾技術(shù)的瞬時(shí)性和不徹底性為后續(xù)基因功能的分析帶來(lái)一定弊端［11］。

基因編輯技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于利用工具細(xì)胞解析特定基因的功能至關(guān)重要。盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在多種細(xì)胞及動(dòng)物模型中廣泛應(yīng)用，然而作為具有吞噬功能的免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞因識(shí)別外源核酸并啟動(dòng)免疫應(yīng)答導(dǎo)致自身極化或死亡而難以轉(zhuǎn)染，外源性質(zhì)粒越大轉(zhuǎn)染難度越大［12-14］。其中小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7常用于炎癥相關(guān)研究，因其缺失與細(xì)胞死亡相關(guān)的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）而備受關(guān)注［15］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者多用病毒介導(dǎo)法進(jìn)行巨噬細(xì)胞RAW 264.7的基因編輯，但由于該方法可能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒和載體動(dòng)員帶來(lái)的生物安全問(wèn)題，需要探索新的基因修飾方法［16-17］。此外，病毒介導(dǎo)法攜帶基因不能太大（＜8000b），而電穿孔法可轉(zhuǎn)染較大的基因組（＞65 000 b，Cas9質(zhì)粒約9500 b）。為使巨噬細(xì)胞的基因編輯更安全高效，本研究采用將Cas9質(zhì)粒與sgRNA分兩步電轉(zhuǎn)的方法，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建gsdmd-/-RAW264.7細(xì)胞，為深入探究GSDMD的功能及其介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡的機(jī)制提供工具和手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒 鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株野生型SL1344由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)楊倩教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室利用λRed重組系統(tǒng)自行構(gòu)建spvC敲除株STM-ΔspvC，利用原核表達(dá)載體pBAD/gⅢA構(gòu)建spvC全序列回補(bǔ)株STM-c-spvC，相關(guān)質(zhì)粒由普渡大學(xué)周道國(guó)教授惠贈(zèng)。RAW264.7細(xì)胞由蘇州大學(xué)王國(guó)卿教授惠贈(zèng)。pUC57、pGL3和Cas9質(zhì)粒由蘇州大學(xué)劍橋-蘇大基因組資源中心張文勝教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 T4DNALigase，DL5000 DNAladderr，Proteinase K（TaKaRa）；BsmBⅠ限制性內(nèi)切酶（NEB）；DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、2×Rapid Taq Master Mix（Vazyme）；質(zhì)粒小提試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒（天根生化）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、嘌呤霉素、RIPA細(xì)胞裂解液、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天）；Opti-MEM 培 養(yǎng) 基（HyClone）；Anti-GSDMD antibody（abcam）；EvaGreen 2×qPCR MasterMix、5×All-In-One RTMasterMix（愛(ài)必夢(mèng)生物）。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（Biotek）；電轉(zhuǎn)儀（Lonza）；PowerPac Basic電泳儀（Bio-Rad）；PCR擴(kuò)增儀（朗基科學(xué)）；核酸電泳電泳系統(tǒng)（天能科技）；紫外儀（北京六一）；Viia7熒光定量PCR儀（日立）。

1.2 方法

1.2.1 RAW 264.7-Cas9細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定 將2×106RAW264.7細(xì)胞用100 μL預(yù)熱Opti-MEM重懸，與2μg帶有G418抗性基因（neomycin-resistant）的Cas9質(zhì)粒［18］混均。用電轉(zhuǎn)儀中預(yù)存的條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)。常規(guī)培養(yǎng)48h后換含500 ng/mLG418的完全培養(yǎng)基藥篩。無(wú)大片細(xì)胞死亡后換含250 ng/mL G418完全培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。Trizol法提取細(xì)胞總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用引物（Cas9-F：AAAGCTCAAAGGGTCTCCCG；Cas9-R：TTATCGAGGTTAGCGTCGGC），qPCR檢測(cè)cas9基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，將穩(wěn)定表達(dá)cas9基因的RAW 264.7細(xì)胞命名為RAW264.7-Cas9。

1.2.2 sgRNA序列設(shè)計(jì) 利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站，搜索gsdmd基因（ID：69146）信息。利用Zhang lab實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站（https://zlab.bio/guidedesign-resources），針對(duì)gsdmd基因3號(hào)外顯子分別在其外側(cè)設(shè)計(jì)4條sgRNA（圖1A），選擇兩對(duì)評(píng)分綜合較高的sgRNA，5'端分別加上BsmBⅠ酶切位點(diǎn)的黏性末端（ACCG/AAAC），下劃線處為BsmBⅠ酶切位點(diǎn)，3'端加上sgRNA scaffold同源臂，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成序列（表1）。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Tab.1 Oligonucleotide sequence of sgRNA

1.2.3 pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以pGL3-sgRNA1-sgRNA3為例構(gòu)建pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒。以pUC57質(zhì)粒為模板，分別將sgRNA1和sgRNA3作為引物，PCR擴(kuò)增含U6啟動(dòng)子的DNA片段，即片段sgRNA1-U6-sgRNA3。經(jīng)脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pGL3質(zhì)粒，連接構(gòu)成串聯(lián)載體pGL3-sgRNA1-sgRNA3。挑取陽(yáng)性克隆，利用引物（sgRNA-seq-F：CGATTAGTGAACGGATCTCGACG，sgRNA-seq-R：CTGCCATTTGTCTCGAGGTCGAG）進(jìn)行PCR鑒定（圖1）。根據(jù)電泳結(jié)果將PCR反應(yīng)液送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序鑒定（引物為sgRNA-seq-F）。pGL3-sgRNA2-sgRNA4重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定與上相同。

圖1 靶向gsdmd基因3號(hào)外顯子突變位點(diǎn)的sgRNA設(shè)計(jì)Fig.1 Design of sgRNA targeting the third exon of gsdmd mutation site.A:Strategy for knocking out the third exon of gsdmd gene.B:Diagram of pGL3-sgRNA recombinant plasmid targeting the third exon of gsdmdgene.

1.2.4gsdmd-/-RAW 264.7細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定 將2μg pGL3-sgRNA1-sgRNA3和pGL3-sgRNA2-sgRNA4重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入RAW 264.7-Cas9細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)條件同1.2.1，細(xì)胞在含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至無(wú)大片細(xì)胞死亡后，換含1μg/mL嘌呤霉素?cái)U(kuò)大培養(yǎng)。如圖1B所示在sgRNA外側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物（genotyping-F：ATGCCATCGGCCTTTGAGAA，genotyping-R：GG TAATGGCCAATCCAGCCT），提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定后送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序鑒定（引物為genotyping-F）。

1.2.5 GSDMD蛋白水平鑒定 根據(jù)基因型鑒定結(jié)果，提取細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液4∶1混勻，100℃煮沸5 min。取30μg樣品經(jīng)濃度為12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。置于搖床室溫封閉1 h。用兔抗GAPDH，GSDMD抗體（1∶1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10min。山羊抗兔IgG-HRP（1:3000稀釋）室溫孵育1 h。TBST洗滌后檢測(cè)GSDMD蛋白表達(dá)水平。

1.2.6gsdmd對(duì)RAW 264.7細(xì)胞死亡的影響 將鼠傷寒沙門菌野生株SL1344（STM-WT）分別與RAW264.7及gsdmd-/-RAW 264.7細(xì)胞以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10∶1共培養(yǎng)。感染1 h后，加入含100μg/mL阿米卡星的DMEM培養(yǎng)基殺死胞外菌。作用2 h后，換含10 μg/mL阿米卡星的DMEM培養(yǎng)基抑制胞外菌生長(zhǎng)。于感染24h后PBS輕輕洗滌，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)。依次加入5μLAnnexin V-FITC和10μLPI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育20min，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

將鼠傷寒沙門菌野生株、spvC敲除株及回補(bǔ)株（STM-WT、STM-ΔspvC及STM-c-spvC）分別與RAW 264.7及gsdmd-/-RAW 264.7細(xì)胞共培養(yǎng)建立上述感染模型。感染24 h后于室溫下1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清。同時(shí)設(shè)置無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔作為空白對(duì)照。按照乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)，各組吸光度減去背景空白對(duì)照孔吸光度即為樣品吸光度。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用 Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理 采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析進(jìn)行3組樣本間平均數(shù)的比較，多因素方差分析進(jìn)行多組樣本間兩兩比較，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7-Cas9細(xì)胞的鑒定

與對(duì)照組相比，經(jīng)電轉(zhuǎn)后RAW 264.7細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)有功能的cas9基因（圖2）。

圖2 qPCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞cas9轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 cas9 transcription level in RAW 264.7 analyzed by real-timePCR(****P＜0.01).

2.2 pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果表明sgRNA1～sgRNA4均已成功插入pGL3，且方向、位置均與預(yù)期相符（圖3）。

圖3 pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of pGL3-sgRNA recombinant plasmids.A:Amplification of pGL3-sgRNA recombinant plasmids.M:DL2501 DNA ladder;1.Negative control;2-3:pGL3-sgRNA1-sgRNA4 recombinant plasmids;4-5:pGL3-sgRNA2-sgRNA4 recombinant plasmids.B:Sequencing results of pGL3-sgRNA recombinant plasmids.

2.3 gsdmd-/-RAW264.7細(xì)胞的鑒定

測(cè)序結(jié)果表明sgRNA打靶區(qū)域gsdmd基因的3號(hào)外顯子敲除成功，Western blot結(jié)果顯示目標(biāo)細(xì)胞中GSDMD蛋白不表達(dá)（圖4）。

圖4 gsdmd-/-RAW264.7細(xì)胞的鑒定Fig.4 Identification of gsdmd-/-RAW 264.7 cells.A:Amplification of gsdmd.M:DL5000 DNA ladder;1:Negative control;2:RAW 264.7 cells;3:gsdmd-/-RAW 264.7 cells.B:Comparison of gsdmd knockout with original gene sequence.C:GSDMD expression in RAW 264.7 cells detected by Western blot.

2.4 檢測(cè)GSDMD對(duì)RAW264.7細(xì)胞死亡的影響

AnnexinV-FITC/PI染色結(jié)果表明gsdmd基因敲除后細(xì)胞死亡率顯著降低（圖5A），與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致，gsdmd-/-RAW 264.7各感染組LDH釋放水平顯著低于野生型RAW 264.7細(xì)胞感染組。野生型RAW 264.7細(xì)胞中spvC敲除株感染組LDH釋放水平顯著高于野生株和回補(bǔ)株感染組（P＜0.01，圖5B）。

圖5 gsdmd基因敲除對(duì)RAW264.7細(xì)胞死亡的影響Fig.5 Effect of gsdmd gene knockout on RAW 264.7 cell death.A:Cell death detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining.B:LDH release measured by colorimetry(****P＜0.01).

3 討論

本研究在gsdmd基因內(nèi)含子上設(shè)計(jì)4條sgRNA，分步電轉(zhuǎn)pGL3-sgRNA重組載體及Cas9質(zhì)粒，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建gsdmd基因敲除的巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞。PCR及DNA測(cè)序結(jié)果表明3號(hào)外顯子成功敲除，Western blot結(jié)果證明該細(xì)胞株中GSDMD蛋白表達(dá)完全缺失。

由于RAW 264.7細(xì)胞缺失與細(xì)胞死亡相關(guān)的ASC，因此較能耐受外源性dsDNA電穿引起的細(xì)胞毒性［19］。實(shí)驗(yàn)室前期將pGL3-sgRNA載體與Cas9質(zhì)粒同時(shí)電轉(zhuǎn)導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞，多次實(shí)驗(yàn)均未成功。外源性質(zhì)粒越大轉(zhuǎn)染難度越大。在人外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中，外源質(zhì)粒≥7200 b時(shí)，轉(zhuǎn)染效率低于1.5%，細(xì)胞凋亡率高于88%［14,20］。此外，隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒數(shù)量的增加，CRISPR/Cas9基因編輯的效率顯著下降［21］。本研究采用分步轉(zhuǎn)染法，將較大的約9500 b的Cas9質(zhì)粒先電轉(zhuǎn)導(dǎo)入RAW 264.7細(xì)胞，成功獲得RAW 264.7-Cas9細(xì)胞系，隨后轉(zhuǎn)染兩個(gè)較小的約6000 b的pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒。一方面通過(guò)減少外源基因數(shù)量提高轉(zhuǎn)染效率，另一方面構(gòu)建成功的RAW 264.7-Cas9可作為工具細(xì)胞進(jìn)行其他基因的編輯，為后續(xù)巨噬細(xì)胞的基因編輯奠定基礎(chǔ)。因此，先轉(zhuǎn)染Cas9質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)染sgRNA重組質(zhì)粒有望進(jìn)一步提高CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯的效率。

sgRNA的設(shè)計(jì)與選擇是CRISPR/Cas9技術(shù)的精髓，也是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵一步，它決定了Cas9的靶向性和特異性。研究表明，sgRNA的長(zhǎng)度及兩條sgRNA間的距離可影響打靶效率［22］。不同sgRNA的切點(diǎn)之間的距離越近，效率越高，前期研究常在外顯子內(nèi)部設(shè)計(jì)sgRNA進(jìn)行打靶［23］，然而打靶后僅產(chǎn)生幾個(gè)堿基的缺口，無(wú)法通過(guò)PCR快速初篩，1～2天后方可獲得結(jié)果。Surveyor nuclease assay利用突變的DNA序列與未突變的DNA序列進(jìn)行雜交，形成異源雙鏈后，特異性核酸內(nèi)切酶surveyor可檢測(cè)其點(diǎn)突變，雖特異性高但相比于直接PCR擴(kuò)增耗時(shí)長(zhǎng)且成本高［24］。本研究在外顯子的外側(cè)設(shè)計(jì)sgRNA，將整個(gè)外顯子切除致使上千個(gè)堿基丟失，用PCR擴(kuò)增快速初篩，3 h左右即可獲得結(jié)果，在難以轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞中大大提高了篩查效率。此外，雙向sgRNA介導(dǎo)的基因敲除模式可顯著提高敲除效率［25］。研究表明在兔TYR基因上下游分別設(shè)計(jì)兩條sgRNA，相比于單個(gè)sgRNA的突變效率（sgRNA1：82.6%；sgRNA2：39，1%；sgRNA3：52.1%；sgRNA4：43.5%），4條sgRNA共同作用可將敲除效率提高至100%，且未發(fā)生脫靶效應(yīng)［26］。因此本研究在靶基因上下游分別設(shè)計(jì)兩條sgRNA，與pGL3載體構(gòu)建兩個(gè)串聯(lián)載體：pGL3-sgRNA1-sgRNA3和pGL3-sgRNA2-sgRNA4。經(jīng)PCR、測(cè)序及Western blot鑒定證明gsdmd-/-RAW 264.7細(xì)胞構(gòu)建成功。

鑒于GSDMD在細(xì)胞焦亡中的重要作用，利用本研究構(gòu)建成功gsdmd-/-RAW264.7細(xì)胞分析GSDMD對(duì)巨噬細(xì)胞死亡的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-FITC/PI染色，結(jié)果表明敲除gsdmd可降低沙門菌感染引起的細(xì)胞死亡。將STM-WT，STM-ΔspvC，STM-c-spvC分別與野生型及gsdmd-/-RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)LDH釋放水平，結(jié)果顯示野生型RAW 264.7細(xì)胞中spvC敲除株感染組LDH釋放水平顯著高于攜帶有spvC的沙門菌感染組。gsdmd-/-RAW 264.7各感染組LDH釋放水平顯著低于野生型RAW 264.7細(xì)胞感染組。文獻(xiàn)報(bào)道沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC可抑制腸道早期炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)菌全身播散［27］。課題組前期發(fā)現(xiàn)該作用與其抑制巨噬細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。本研究利用gsdmd-/-RAW 264.7進(jìn)一步證實(shí)spvC可抑制gsdmd介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡。GSDMD作為焦亡的關(guān)鍵蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞死亡后還可招募和激活中性粒等免疫細(xì)胞發(fā)揮“清道夫”作用［28］。由于伴隨焦亡產(chǎn)生的孔誘導(dǎo)胞內(nèi)陷阱（PITs）可束縛胞內(nèi)菌，而通過(guò)焦亡孔道流出的炎癥因子IL-1β和IL-18可募集中性粒細(xì)胞發(fā)揮胞葬作用，二次清除PITs和暴露在胞外的細(xì)菌，從而防止全身感染［29-30］。因此推測(cè)敲除焦亡關(guān)鍵基因gsdmd可減少IL-1β和IL-18的分泌，從而抑制中性粒細(xì)胞的募集。另有研究表明沙門菌進(jìn)入中性粒細(xì)胞后可引起GSDMD依賴的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）的釋放，捕獲并殺滅胞外菌［31］。因此GSDMD對(duì)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的協(xié)同抗菌作用意義重大。

綜上，本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建的gsdmd-/-RAW 264.7細(xì)胞，并分析gsdmd對(duì)沙門菌感染引起的巨噬細(xì)胞死亡的影響，為后續(xù)探究GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞死亡及其參與的固有免疫反應(yīng)對(duì)細(xì)菌播散的影響提供可利用的細(xì)胞模型。