人參皂苷20(S)-Rg3通過(guò)抑制DNMT3A介導(dǎo)的啟動(dòng)子甲基化促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中抑癌基因VHL的表達(dá)

王莉潔，韓 曦 ，鄭 霞，周園園，侯惠蓮 ，陳 葳，李 旭 ，趙 樂(lè)

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院1轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，5婦產(chǎn)科，6病理科，7檢驗(yàn)科，8陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710061；2蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦科，甘肅 蘭州 730030；3陜西省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710068；4浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 杭州 310009

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤［1］。因卵巢位于盆腔深部、卵巢癌早期無(wú)特異性的癥狀和體征，加之缺乏有效的早期篩查方法和特異的診斷指標(biāo)，導(dǎo)致卵巢癌難以被早期發(fā)現(xiàn)，約三分之二的卵巢癌患者于中晚期才被確診［2］。目前，晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為15%～45%［3］。因此，改善晚期卵巢癌患者的預(yù)后是亟待解決的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。篩選獲得靶向關(guān)鍵分子的卵巢癌治療新藥將是改善卵巢癌患者治療效果的一個(gè)重要途徑。

人參皂苷是人參具有藥物活性的精華成分［4］。目前已分離獲得70種以上的人參皂苷單體，包括Ra1-3、Rb1-3、Rg1、Rg3、Rh1等［5］。其中Rg3的抗腫瘤活性吸引了眾多注目，已報(bào)道Rg3在膠質(zhì)瘤［6］、結(jié)腸癌［7］、肺癌［8］、前列腺癌［9］、乳腺癌［10］、宮頸癌［11］、卵巢癌［12］等多種腫瘤中具有抗腫瘤作用。Rg3根據(jù)第20位碳原子（C20）上羥基的空間位置而分為20(S)-Rg3和20(R)-Rg3兩個(gè)同型異構(gòu)體［13］。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，20(S)-Rg3通過(guò)上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中的von Hippel-Lindau（VHL）的表達(dá)而減弱卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［12］。VHL的一個(gè)重要功能是介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解［14］。常氧下，HIF-1α的關(guān)鍵脯氨酸殘基由脯氨酸羥化酶區(qū)域蛋白羥基化，使得HIF-1α被VHL/E3泛素連接酶復(fù)合物識(shí)別，進(jìn)而被多泛素化并被26S蛋白酶體降解［15］。VHL基因失活則使得HIF-1α蓄積，進(jìn)而促進(jìn)VEGF、TGF-α等細(xì)胞因子表達(dá)，加快細(xì)胞能量代謝、血管生長(zhǎng)等過(guò)程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［16］。VHL基因的失活機(jī)制主要包括基因突變、雜合性缺失和基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化［17-18］。但是，20(S)-Rg3上調(diào)抑癌基因VHL的機(jī)制尚不明確。

本研究從DNA甲基化這一轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控機(jī)制入手，發(fā)現(xiàn)20(S)-Rg3通過(guò)下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A而削弱了其介導(dǎo)的VHL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，使得VHL表達(dá)水平升高，為20(S)-Rg3能成為治療卵巢癌的新型藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；人參皂苷20(S)-Rg3（天士力制藥集團(tuán)股份有限公司）；1640培養(yǎng)基（GIBCO）；5-Aza-CdR（Sigma）；DNMT3A過(guò) 表 達(dá) 載 體（Addgene）［19］。 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 試 劑 X-tremeGENE HP（Roche）；基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技）；EZ-DNA Methylation-Direct試劑盒（Zymo Research）；RNA提取試劑盒RNAfast 200（上海飛捷生物）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid first strand cDNA synthesis Kit（Thermo Fisher）；甲基化PCR試劑盒Epi Taq HS和real-time PCR試劑SYBR Green Master Mix（TaKaRa）；小鼠抗人β-actin多克隆抗體、兔抗人VHL多克隆抗體、兔抗人DNMT3A單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；HRP-羊抗兔/鼠IHC二抗試劑盒（福州邁新生物技術(shù)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與20(S)-Rg3處理

SKOV3細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2、100%濕度的條件下培養(yǎng)。種板后24 h使細(xì)胞密度達(dá)到50%，更換新的完全培養(yǎng)基，并加入終濃度為80 μg/mL的20(S)-Rg3，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取總DNA、RNA或48h后提取總蛋白備用。

1.3 使用5-Aza-CdR處理細(xì)胞

3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后細(xì)胞匯合度達(dá)到40%～50%時(shí)加5-Aza-CdR儲(chǔ)存液（10mmol/L）使其終濃度分別達(dá)到1、2或5 μmol/L。放入37℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h提取總RNA。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

4×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，約24h后細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)按照X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。每孔使用轉(zhuǎn)染試劑6 μL，質(zhì)粒2 μg。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h提取總RNA，72h提取總蛋白。

1.5 DNA提取、重亞硫酸鹽處理和甲基化特異性PCR（MSP）

利 用 MethPrimer（http://www.urogene.org/methprimer/）獲取VHL基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島信息，并設(shè)計(jì)MSP引物（序列信息見(jiàn)表1）。提取基因組DNA后，用EZ DAN Methylation-Direct Kit進(jìn)行DNA重亞硫酸鹽處理及純化回收。按下列體系進(jìn)行MSP反應(yīng)：Epi Taq HS 0.1 μL，10×Epi Taq PCR Buffer 2 μL，dNTP mixture 2.4 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，硫化的DNA＜40 ng，滅菌水補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件：94℃ 5 min，之后 94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72℃30 s，32個(gè)循環(huán)，之后72℃10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與real-time PCR

按照RNAFast200試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。核酸蛋白濃度分析儀檢測(cè)RNA濃度和A260/280比值。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid first strand cDNA synthesis Kit進(jìn)行 RNA 反轉(zhuǎn)錄：總 RNA 2 μg，random hexamer primer1 μL，用nuclease-free water補(bǔ)足體積到12 μL，在PCR儀中65℃5 min，然后冰上急冷5 min；再加入5×Reaction Buffer 4 μL，dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，將PCR管放入預(yù)熱的PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件25℃5 min，42℃60min，70℃5min。將得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。按照SYBR Green Master Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行realtime PCR反應(yīng)：2×SYBRP remix Ex Taq10μL，10μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA1 μL，滅菌水7.4 μL，realtime PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30 s，然后95℃5 s、60℃30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，之后接熔解曲線條件。采用CFX-96 real-time PCR system（Bio Rad）軟件通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

1.7 Westernblotting

提取總蛋白，BCA法定量，蛋白變性后按照每孔30 μg進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，320 mA轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜（均為1∶1000），二抗室溫孵育1h（1∶2000），化學(xué)發(fā)光。

1.8 20(S)-Rg3治療的裸鼠皮下移植瘤組織以及對(duì)照組織切片的制備

課題組前期進(jìn)行了20(S)-Rg3治療裸鼠皮下移植瘤的實(shí)驗(yàn)［12］，在裸鼠左前肢背側(cè)皮下接種SKOV3細(xì)胞懸液0.1 mL（2×106個(gè)），10 d后腫瘤體積大于10 mm3時(shí)隨機(jī)將裸鼠分成對(duì)照組和20(S)-Rg3干預(yù)組，后續(xù)30 d中干預(yù)組隔天尾靜脈注射5 mg/kg的20(S)-Rg3，對(duì)照組則尾靜脈注射相同體積的PBS。觀察結(jié)束時(shí)頸椎脫臼處死裸鼠，剝離腫瘤，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片。

1.9 免疫組織化學(xué)

石蠟脫蠟、水化，高壓抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：VHL和DNMT3A以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽(yáng)性。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間差異比較采用獨(dú)立樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)。甲基化特異PCR結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20(S)-Rg3上調(diào)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的VHL表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，終濃度80 μg/mL的20(S)-Rg3處理24 h后卵巢癌細(xì)胞SKOV3的VHLmRNA水平顯著升高（圖1A）。與mRNA水平的變化一致，Western blotting結(jié)果顯示，20(S)-Rg3令SKOV3細(xì)胞的VHL蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)（圖1B）。

圖1 20(S)-Rg3上調(diào)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的VHLFig.1 20(S)-Rg3 upregulates VHL in ovarian cancer cell line SKOV3.A:Real-time PCR shows elevatated VHL mRNA levelin 20(S)-Rg3-treated cells;B:Western blotting shows increased VHL protein level in20(S)-Rg3-treated cells.*P＜0.05.

2.2 20(S)-Rg3降低卵巢癌細(xì)胞中VHL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中VHL的mRNA水平隨著DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）處理濃度的增加而升高（圖2A）。調(diào)取VHL基因序列上游3000個(gè)堿基作為其啟動(dòng)子區(qū)域，采用MethPrimer在線分析發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域存在CpG島（圖2B）。甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果顯示，20(S)-Rg3處理后卵巢癌細(xì)胞SKOV3的VHL啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平下降（圖2C）。

圖2 20(S)-Rg3降低VHL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平Fig.2 20(S)-Rg3 reduces methylation level in VHL gene promoter.A:Real-time PCR shows increased VHL mRNA level in 5-Aza-CdR-treated SKOV3 cells;B:The promoter region of VHL gene is predicted to contain CpG islands;C:MSP results show significantly decreased methylation level in the promoter region of VHL gene by 20(S)-Rg3.U=Unmethylated.M=Methylated.*P＜0.05.

2.3 20(S)-Rg3通過(guò)下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A表達(dá)而增強(qiáng)VHL的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，在用20(S)-Rg3處理卵巢癌細(xì)胞SKOV3后，DNMT3A的RNA水平下降、DNMT3B的RNA水平略有升高，但DNMT1的RNA水平無(wú)顯著變化（圖3A）。Western blotting結(jié)果顯示DNMT3A的蛋白水平明顯降低，而DNMT3B和DNMT1蛋白水平無(wú)明顯變化（圖3B）。在卵巢癌細(xì)胞SKOV3中過(guò)表達(dá)DNMT3A以及過(guò)表達(dá)DNMT3A同時(shí)用20(S)-Rg3處理，real-time PCR和Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，單純過(guò)表達(dá)DNMT3A后VHL的mRNA和蛋白水平均較對(duì)照組下降，DNMT3A過(guò)表達(dá)拮抗了20(S)-Rg3上調(diào)VHL表達(dá)的作用（圖3C、D）。MSP結(jié)果顯示單純過(guò)表達(dá)DNMT3A后，VHL基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平升高（圖3E）。

圖3 20(S)-Rg3通過(guò)抑制DNMT3A介導(dǎo)的DNA甲基化而上調(diào)VHLFig.3 20(S)-Rg3 upregulates VHL via suppressing DNMT3A-mediated methylation in the promoter region of VHL gene.A:Real-time PCR results show that 20(S)-Rg3 treatment decreases DNMT3A mRNA level and increases DNMT3B mRNA level without affecting DNMT1 mRNAin the cells;B:Western blotting results show that 20(S)-Rg3 treatment decreases DNMT3A and increases DNMT3B protein expressions without affecting DNMT1 expression in the cells;C:Real-time PCR shows reduced VHL mRNA level in 20(S)-Rg3-treated cells overexpressing DNMT3A;D:Western blotting results show lowered VHL protein expression in 20(S)-Rg3-treated cells overexpressing DNMT3A;E:MSP results show increased methylation level in the promoter region of VHL gene in 20(S)-Rg3-treated cells overexpressing DNMT3A.U=Unmethylated.M=Methylated.Ns:non-significant;*P＜0.05.

2.4 免疫組化檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織中VHL和DNMT3A的表達(dá)結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，20(S)-Rg3治療過(guò)的移植瘤組織中VHL表達(dá)升高而DNMT3A表達(dá)降低（圖4）。

圖4 20(S)-Rg3治療的SKOV3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤組織中VHL表達(dá)增強(qiáng)而DNMT3A表達(dá)減弱Fig.4 Immunohistochemical staining showing increased VHL and lowered DNMT3A expressions in subcutaneous tumors derived SKOV3 cells in 20(S)-Rg3-treated nude mice(Original magnification,×200;insets,×400).

3 討論

本研究證實(shí)20(S)-Rg3下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中DNMT3A的蛋白水平，從而抑制其介導(dǎo)的VHL基因啟動(dòng)子甲基化，促進(jìn)VHL的表達(dá)。

20(S)-Rg3抑制卵巢癌細(xì)胞惡性表型的重要機(jī)制之一為上調(diào)抑癌基因VHL基因，但相關(guān)分子機(jī)制不明［12,20］。在卵巢癌細(xì)胞中，20(S)-Rg3在mRNA水平即上調(diào)VHL，提示VHL mRNA轉(zhuǎn)錄增多或降解減少，相關(guān)調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平，如啟動(dòng)子CpG島甲基化、非編碼RNA等表觀遺傳調(diào)控或轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等。5-Aza-CdR升高VHLmRNA水平的現(xiàn)象反映出VHL受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的負(fù)調(diào)控，而當(dāng)使用20(S)-Rg3處理后，哺乳動(dòng)物體內(nèi)3種主要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中，僅催化從頭甲基化的DNMT3A表達(dá)下降，而維持DNA甲基化的DNMT1和催化從頭甲基化的DNMT3B表達(dá)無(wú)變化，提示20(S)-Rg3導(dǎo)致的人卵巢癌細(xì)胞VHL表達(dá)上調(diào)可能與DNMT3A有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了20(S)-Rg3下調(diào)DNMT3A蛋白水平、抑制其介導(dǎo)的DNA甲基化這一表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，最終促進(jìn)了VHL表達(dá)。這與研究報(bào)道的腫瘤中VHL的低表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化相關(guān)的結(jié)果相符［21-22］。DNMT3A在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用，其在卵巢癌組織中異常高表達(dá)，參與促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等［23］。下調(diào)DNMT3A蛋白水平是20(S)-Rg3抑制卵巢癌細(xì)胞惡性表型的另一重要機(jī)制。20(S)-Rg3不影響DNMT1和DNMT3B的表達(dá)，僅下調(diào)DNMT3A，顯示20(S)-Rg3對(duì)DNMT3A的抑制作用具有一定的特異性。文獻(xiàn)報(bào)道DNMT3A的蛋白表達(dá)水平受到microRNA的負(fù)調(diào)控［24-26］，同時(shí)其蛋白穩(wěn)定性受到泛素-蛋白酶體途徑的調(diào)控［27-28］。我們已獲得了20(S)-Rg3影響的卵巢癌細(xì)胞microRNA表達(dá)譜，但尚未鑒定到靶向抑制DNMT3A的microRNA［29］。有關(guān)20(S)-Rg3降低DNMT3A蛋白水平的機(jī)制有待探討。此外，我們前期發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞中DNMT3A通過(guò)介導(dǎo)microRNA前體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化而抑制部分具有抑癌作用的microRNA包括miR-532-3p、miR-603等的表達(dá)，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［29-32］，本研究獲得的DNMT3A抑制VHL表達(dá)的證據(jù)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步豐富了DNMT3A促癌作用的分子機(jī)制。

綜上，人參皂苷20(S)-Rg3通過(guò)削弱DNMT3A介導(dǎo)的啟動(dòng)子甲基化而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中VHL的表達(dá)，這一結(jié)果拓展了對(duì)20(S)-Rg3抗卵巢癌分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為20(S)-Rg3成為臨床治療卵巢癌的候選藥物提供了一定的理論依據(jù)。