CCN3對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增殖的影響

陳世鈺，蘇 欣，劉俊平，石宇彤，吳敏敏，徐夢(mèng)歧，張鳳梅，唐 敏

重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院//臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016

骨折是最常見的骨損傷情況之一，數(shù)據(jù)顯示有5-10%的骨折為難治性骨損傷，其主要是由于多種情況導(dǎo)致機(jī)體自身骨修復(fù)能力下降，這類患者可通過骨組織工程進(jìn)行治療［1］。骨組織工程通過補(bǔ)充骨生長(zhǎng)因子、移植骨替代品以及干細(xì)胞，提高骨缺損部位的骨再生能力，達(dá)到骨修復(fù)目的［1-2］。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）由于具有良好的自我增殖和多向分化能力，是骨組織工程重要種子細(xì)胞，但外源性間充質(zhì)干細(xì)胞由于來源有限、增殖衰老和異質(zhì)性等的問題［3-4］，臨床應(yīng)用受限，目前骨組織工程主要采用無MSCs的治療［1,5］，也就是單獨(dú)或聯(lián)合使用骨支架和成骨生長(zhǎng)因子（BMP2等）進(jìn)行治療。然而，大量回顧性研究發(fā)現(xiàn)，無MSCs的骨組織工程的臨床治療效果不如預(yù)期，同時(shí)還因?yàn)閯┝繂栴}易出現(xiàn)異位成骨、強(qiáng)免疫反應(yīng)等副作用［1-2,4］。因此，我們思考能否通過促進(jìn)機(jī)體骨損傷部分、即自身的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量增加，解決骨修復(fù)所需種子細(xì)胞來源問題，再結(jié)合促成骨因子、骨支架，促進(jìn)難治性骨損傷的愈合呢？為此，我們?cè)谇捌陂g充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制研究基礎(chǔ)上［6］，探討細(xì)胞因子對(duì)MSCs增殖、凋亡的影響和機(jī)制，期望能發(fā)現(xiàn)能刺激骨損傷部位自身間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量增多的細(xì)胞因子，以促進(jìn)骨組織工程在臨床中的應(yīng)用。

CCN3（NOV/CCN3）是由Ccn基因編碼的一種細(xì)胞外分泌蛋白，在人體多個(gè)組織中均有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、有絲分裂以及腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展等諸多生物過程［7-9］。近年來研究發(fā)現(xiàn)CCN3的表達(dá)與骨形成和發(fā)育密切相關(guān)［9-11］，且CCN3可作為Notch分泌型配體激活Notch信號(hào)通路［12］。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCN3參與調(diào)控Notch對(duì)BMPs誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程［13］，然而目前尚未見到關(guān)于CCN3對(duì)MSCs增殖、凋亡影響的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）已被證實(shí)在體內(nèi)外均具有MSCs的特性，其作為MSCs研究模型被越來越多的運(yùn)用在MSCs相關(guān)研究中［14-16］。綜上，本研究擬以MEFs作為研究對(duì)象，利用重組腺病毒過表達(dá)及干擾CCN3表達(dá)，探討CCN3對(duì)MEFs增殖和凋亡的影響及其潛在作用機(jī)制。本研究結(jié)果將豐富調(diào)控MSCs生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的基礎(chǔ)研究結(jié)果，且可為解決骨組織工程中種子細(xì)胞來源問題提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 腺病毒、細(xì)胞株 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEFs，人腎上皮細(xì)胞系HEK 293細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。過表達(dá)綠色熒光蛋白腺病毒（Ad-GFP）、過表達(dá)紅色熒光蛋白腺病毒（Ad-RFP）、過表達(dá)CCN3腺病毒（Ad-CCN3）、干擾CCN3腺病毒（AdsiCCN3）均由芝加哥大學(xué)何通川教授饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自重慶賽米克公司；胎牛血清（FBS，太倉依科賽）；Polybrene以及茜素紅S（Sigma）；堿性磷酸酶染色試劑盒、Western blot相關(guān)試劑及IP細(xì)胞裂解液（碧云天）；RNA提取試劑盒（奕杉）；RT-PCR試劑盒和SYBR GreenⅠ（TaKaRa）；CCN3 ELISA試劑盒以及兔抗鼠ERK1+2、p-ERK1+2抗體（Abcam）；PVDF膜以及化學(xué)發(fā)光HRP底物（Millipore）；鼠抗鼠β-actin單克隆抗體（鐘鼎）；兔抗鼠PCNA、Bax、Bcl-2以及乙?；疕3K9抗體（CST）；兔抗鼠Cyclin E、Cyclin B1抗體（萬類生物科技）；牛血清粉BSA（索萊寶）；胰蛋白酶以及羊抗兔、羊抗鼠二抗（中杉金橋）；磷酸鹽粉（博士德）；引物分別于北京擎科公司以及上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)及購買。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞MEFs、人腎上皮細(xì)胞系HEK 293細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素（P/S）的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5% CO2飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁融合至70%～80%（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化繼續(xù)傳代。

1.2.2 腺病毒處理細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MEFs鋪板（24孔板，5×105/孔）檢測(cè)病毒滴度。觀察感染率約為30%的對(duì)應(yīng)孔病毒滴度并在熒光顯微鏡下拍照。確定病毒滴度后，培養(yǎng)MEFs至30%密度左右，加入Polybrene穿孔素（4μL/500μL培養(yǎng)基），再按所測(cè)病毒滴度處理細(xì)胞，加病毒6～8 h后更換培養(yǎng)基為無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基。綠色熒光于處理后24 h在熒光顯微鏡下觀察熒光，紅色熒光于處理后36小時(shí)在熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 利用Ad-GFP、Ad-RFP、Ad-CCN3、Ad-siCCN3腺病毒感染細(xì)胞，2d后進(jìn)行細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

細(xì)胞周期檢測(cè)：吸去培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化細(xì)胞，冰PBS洗滌細(xì)胞3次，隨后離心沉淀細(xì)胞，棄上清，用70%預(yù)冷的乙醇重懸，4℃過夜，最后經(jīng)流式細(xì)胞儀，采用碘化丙啶（PI）DNA染色法檢測(cè)細(xì)胞周期情況。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)：吸去培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化細(xì)胞，冰PBS洗滌細(xì)胞3次，離心沉淀細(xì)胞，棄上清，PBS重懸，最后經(jīng)流式細(xì)胞儀，綜合采用Annexin-ⅤAPC-A/DAPI PD450-A雙染法以及AnnexinV-FITC單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 ELISA實(shí)驗(yàn) 采用Ad-GFP、Ad-RFP、Ad-CCN3、Ad-siCCN3腺病毒感染細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，2000g離心10 min后取上清液按照試劑盒說明書進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下：將所有材料和試劑放至室溫后稀釋樣本至試劑盒檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，孔板內(nèi)加入50μL樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，隨后加入50μL抗體混合物密封，400 r/min搖板室溫孵育1 h，350 μL1×洗液/孔，洗滌3次后，加入100μLTMB底物，400 r/min的搖板機(jī)避光室溫孵育10 min后，每孔加入100μL終止液，振蕩混勻1min，酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm吸光度。

1.2.5 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá) 腺病毒感染細(xì)胞后，于培養(yǎng)第3天時(shí)利用RNA快提取試劑盒提取RNA，并測(cè)定RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后進(jìn)行RTPCR實(shí)驗(yàn)，并采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR使用的引物序列見表1。

1.2.6 總蛋白提取和Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平總蛋白提取：腺病毒感染細(xì)胞后，于細(xì)胞培養(yǎng)至第3天時(shí)提取蛋白質(zhì)。棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗3次，向培養(yǎng)板中加1mL預(yù)冷PBS，刮下細(xì)胞，吸至1.5 mL EP管中，5000 r/min，4 ℃，5min，棄上清，加入細(xì)胞蛋白裂解液100μL/管，混勻，每溶10 min震蕩1次，共3次，12 000 r/min，4℃，20 min，取上清90μL至新的EP管中，留取10μL測(cè)蛋白濃度備用，90μL中加入22.5μL 5×蛋白上樣緩沖液，混勻，封口膠封口，沸水浴5～10min，-20℃保存。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物表Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

Western blot實(shí)驗(yàn)：根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量配膠，加入適量蛋白進(jìn)行電泳，恒壓濃縮（90 V）和分離（120 V）蛋白，恒流（210 mA）將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出PVDF膜，BSA或5%脫脂牛奶37℃封閉2 h，然后加入相對(duì)應(yīng)的一抗（1∶1000稀釋）于4℃放置12～16 h。在震蕩儀上用TBST洗膜10 min/次，一共3次。然后加入相對(duì)應(yīng)的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG二抗（1∶5000稀釋）于37℃孵育1 h，TBST洗膜10 min/次，最后于化學(xué)發(fā)光成像儀成像。顯色結(jié)果用Image Lab軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒效果鑒定

熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示Ad-GFP、Ad-CCN3加入約24 h后，可在MEF細(xì)胞中觀察到明顯的綠色熒光（圖1A左），且RT-qPCR結(jié)果表明，與Ad-GFP對(duì)照組相比，Ad-CCN3處理組細(xì)胞內(nèi)CCN3表達(dá)量明顯增高（圖1B，P＜0.05）；Ad-RFP、Ad-siCCN3加入約36 h后，MEF細(xì)胞中可以觀察到明顯的紅色熒光（圖1A右），RT-qPCR結(jié)果顯示，與Ad-RFP對(duì)照組相比，Ad-siCCN3組CCN3表達(dá)量降低（圖1C，P＜0.001）。

圖1 腺病毒感染間充質(zhì)干細(xì)胞情況Fig.1 Mouse embryonic fibroblasts(MEFs)transfected with different adenovirus vectors for CCN3 over-expression or knockdown.A:MEFs with CCN3 over-expression and knockdown under fluorescence microscope.B:CCN3 mRNA expression level in MEFs over-expressing CCN3 detected by RT-qPCR(*P＜0.05).C:CCN3 mRNA expression level in MEFs with CCN3 knockdown detected by RT-qPCR(***P＜0.001).

2.2 CCN3促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖

與Ad-GFP對(duì)照組相比，Ad-CCN3組S期細(xì)胞百分比明顯增加，增殖指數(shù)PI指數(shù)明顯增加（圖2A、B，P＜0.01）；Ad-siCCN3組，細(xì)胞周期無明顯變化（圖2C、D，P＞0.05）。腺病毒感染36 h后提取總蛋白檢測(cè)經(jīng)典增殖標(biāo)志蛋白PCNA、G1/S期周期蛋白標(biāo)志物Cyclin E和G2/M期標(biāo)志蛋白Cyclin B1表達(dá)，結(jié)果顯示與Ad-GFP對(duì)照組相比，Ad-CCN3組PCNA表達(dá)明顯增加，Cyclin E表達(dá)顯著增加，而Cyclin B1表達(dá)減少（圖2F，P＜0.05），Ad-siCCN3組則無明顯變化（圖2E、F）。

圖2 CCN3對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of CCN3 over-expression or knockdown on proliferation of MEFs.A,B:Effect of CCN3 overexpression on cell cycle detected by flow cytometry.C,D:Effect of CCN3 knockdown on cell cycle detected by flow cytometry.E,F:Expression levels of PCNA,cyclin E and cyclin B1 in MEFs with CCN3 over-expression or knockdown detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.3 CCN3抑制間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡

Ad-CCN3組與Ad-GFP對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡百分比顯著降低，其中晚期凋亡細(xì)胞百分比降低更為明顯（圖3A、C，P＜0.05）；Ad-siCCN3組與Ad-RFP對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡百分比增加（圖3B、D，P＜0.05）。隨后腺病毒處理36 h后，提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)凋亡抑制蛋白Bcl-2、凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)變化情況。與對(duì)照組相比，Ad-CCN3組Bax蛋白表達(dá)減少（圖3E、F，P＜0.05），Bcl-2表達(dá)顯著增加（圖3E、F，P＜0.01），Add-siCCN3組Bax表達(dá)無明顯變化（圖3E、F，P＞0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)減少（圖3E、F，P＜0.01）。

圖3 CCN3對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of CCN3 over-expression or knockdown on MEF apoptosis.A,C:The effect of overexpression of CCN3 on apoptosis was detected by flow cytometry(*P＜0.05).B,D:The effect of Ad-siCCN3 on apoptosis was detected by flow cytometry(*P＜0.05).E,F:The expression levels of pro-apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 after transfection by CCN3 and siCCN3 viruses detected by Western blotting(*P＜0.05,**P＜0.01).

2.4 不同處理下CCN3分泌情況

ELISA結(jié)果顯示：MEFs細(xì)胞為低密度時(shí)（30%）CCN3濃度在為0.27 ng/mL左右，中等密度（60%）CCN3濃度為0.97～1.05 ng/mL左右，高密度（90%）CCN3濃度為16.04～27.71 ng/mL左右（圖4A）。隨后ELISA試劑盒檢測(cè)腺病毒感染后CCN3表達(dá)情況結(jié)果顯示：以高細(xì)胞密度組CCN3表達(dá)為對(duì)照，Ad-CCN3組CCN3濃度增加至849.62～1629.48 ng/mL之間，而siCCN3組CCN3的濃度在9.09～22.5 ng/mL之間，略低于正常水平（圖4B）。

圖4 不同情況下CCN3表達(dá)水平Fig.4 CCN3 secretion level in MEFs cultured under different conditions or with CCN3 over-expression or knockdown.A:CCN3 secretion levels by MEFs cultured at different cell densities(30%,60%,and 90%)detected by ELISA.B:CCN3 secretion levels in MEFs cells with CCN3 over-expression or knockdown detected by ELISA.

2.5 CCN3抑制經(jīng)典Notch信號(hào)通路

與Ad-GFP對(duì)照組相比，Ad-CCN3處理組Notch1 mRNA表達(dá)增加（圖5A，P＜0.001），Hey1 mRNA表達(dá)減少（圖5B，P＜0.01），p300 mRNA表達(dá)減少（圖5C，P＜0.05），組蛋白H3K9表達(dá)減少（圖5D、E，P＜0.01）；Ad-siCCN3組結(jié)果則剛好相反，與Ad-RFP對(duì)照組相比，Notch1 mRNA表達(dá)減少（圖5A，P＜0.05），Hey1和p300 mRNA表達(dá)明顯增加（圖5B、C，P＜0.05；P＜0.01），組蛋白H3K9表達(dá)增加（圖5D、E，P＜0.05）。此外RTPCR結(jié)果顯示，過表達(dá)CCN3能抑制DLL1 mRNA表達(dá)（圖5F，P＜0.01），干擾CCN3可促進(jìn)DLL1mRNA表達(dá)（圖5F，P＜0.05），而過表達(dá)DLL1抑制CCN3 mRNA表達(dá)（圖5G，P＜0.05）。

圖5 CCN3抑制經(jīng)典Notch信號(hào)通路Fig.5 CCN3 inhibits the classical Notch signaling pathway.A:The influence of Ad-CCN3 and Ad-siCCN3 on the mRNA expression of Notch1 was detected by RT-qPCR(*P＜0.05,***P＜0.001).B:RT-qPCR was used to detect the effects of overexpression of CCN3 and siCCN3 on Hey1 mRNA expression(*P＜0.05,**P＜0.01).C:RT-qPCR was used to detect the effects of overexpression of CCN3 and siCCN3 on p300 mRNA expression(*P＜0.05,**P＜0.01).D,E:The protein expression levels of acetylated histone H3K9 after transfection of CCN3 and siCCN3 viruses determined by Western blot(*P＜0.05,**P＜0.01).F:RT-qPCR was used to detect the effects of overexpression of CCN3 and siCCN3 on DLL1 mRNA expression(*P＜0.05,**P＜0.01).G:RT-qPCR was used to detect the effects of overexpression of DLL1 on CCN3 mRNA expression(*P＜0.05).

2.6 CCN3激活ERK/MAPK信號(hào)通路

與Ad-GFP對(duì)照組相比，Ad-CCN3處理組ERK1+2和p-ERK1+2蛋白表達(dá)增加（圖6，P＜0.001，P＜0.01）；與Ad-RFP對(duì)照組相比，Ad-siCCN3組ERK1+2蛋白表達(dá)量無明顯變化（圖6，P＞0.05），p-ERK1+2蛋白表達(dá)減少（圖6，P＜0.05）。

圖6 CCN3激活ERK/MAPK信號(hào)通路Fig.6 CCN3 over-expression activates the ERK/MAPK signaling pathway in MEFs.A,B:Protein expression levels of ERK1+2 and p-ERK1+2in MEFs with CCN3 over-expression or knockdown determined by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

近年來骨組織工程作為難治性骨損傷的重要治療手段，越來越受到臨床重視。其通過各種方式促進(jìn)骨損傷部位的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，實(shí)現(xiàn)骨修復(fù)［17］，因此，保障骨損傷部位間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量對(duì)骨修復(fù)能力至關(guān)重要，然而外源性間充質(zhì)干細(xì)胞由于存在來源有限、異質(zhì)性以及增殖衰老發(fā)育機(jī)制不清楚等問題限制了其使用［18-19］，因此，擬在前期對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制，探索能夠促進(jìn)機(jī)體自身間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量增多的方法，為改進(jìn)骨組織工程治療策略、提高骨組織工程的臨床治療效果提供思路和依據(jù)。

腎母細(xì)胞瘤過表達(dá)因子CCN3近年來被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及骨再生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［20-22］。前期研究發(fā)現(xiàn)，DLL1/Notch信號(hào)通路能明顯促進(jìn)BMPs調(diào)控的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化［23］，而CCN3卻明顯抑制間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化［13］。因?yàn)樵鲋澈头只羌?xì)胞功能兩個(gè)不同的方向，因此，我們考慮CCN3在這一過程中，是否是作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖因子存在。查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有研究結(jié)果表明CCN3可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞DPSCs以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖［21,24］，而也有學(xué)者的研究結(jié)果所得結(jié)論恰好與之相反［25-27］，這間接提示CCN3調(diào)控細(xì)胞增殖機(jī)制復(fù)雜，值得進(jìn)一步研究。

本研究利用重組CCN3腺病毒感染細(xì)胞，探究CCN3對(duì)細(xì)胞增殖的影響及潛在機(jī)制。結(jié)果顯示：上調(diào)MEFs中CCN3表達(dá)，能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，這與CCN3對(duì)Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞作用中的發(fā)現(xiàn)一致［28］，而這一過程中，G1/S期標(biāo)志周期蛋白Cyclin E的表達(dá)增加，G2/M期Cyclin B1的表達(dá)則是下調(diào)的，提示CCN3可能是通過影響細(xì)胞G1/S期調(diào)控細(xì)胞增殖。然而與預(yù)期結(jié)果不一致的是干擾CCN3表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。考慮到CCN3是一種分泌型蛋白，其發(fā)揮調(diào)控作用受到其濃度的影響，且已有研究表明不同濃度CCN3對(duì)成骨分化和細(xì)胞增殖作用不同［10,28-29］，我們進(jìn)一步檢測(cè)不同處理情況下CCN3的表達(dá)量，ELISA結(jié)果顯示，MEFs中CCN3的基礎(chǔ)表達(dá)量約為21.87ng/mL，腺病毒處理后可顯著上調(diào)細(xì)胞CCN3分泌，約為基礎(chǔ)表達(dá)量的60倍，然而Ad-siCCN3感染后僅在細(xì)胞基礎(chǔ)表達(dá)量上輕微下調(diào)CCN3表達(dá)，因此我們猜測(cè)Ad-siCCN3組結(jié)果與預(yù)期不符的原因可能由于是腺病毒下調(diào)CCN3表達(dá)量不足以影響細(xì)胞增殖，這一猜想尚需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究中，我們還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CCN3能夠抑制MEFs細(xì)胞凋亡，提示CCN3同時(shí)還通過抑制細(xì)胞凋亡的途徑增加細(xì)胞數(shù)量。

那么CCN3是通過什么途徑調(diào)控MEFs增殖的呢？因?yàn)镃CN3已經(jīng)被證實(shí)可與Notch1結(jié)合，是Notch信號(hào)通路的非經(jīng)典配體之一［12］。于是我們首先檢測(cè)了CCN3對(duì)Notch信號(hào)通路的激活，RT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)CCN3能促進(jìn)Notch1 mRNA表達(dá)，而siCCN3則抑制其表達(dá)，證實(shí)CCN3的確可激活Notch1。然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CCN3明顯抑制了Notch經(jīng)典通路中靶基因Hey1和p300 mRNA表達(dá)，Western blot結(jié)果也顯示組蛋白乙?；矫黠@下降；干擾CCN3后結(jié)果剛好相反，提示過表達(dá)CCN3雖然激活Notch1，但在功能上卻抑制了經(jīng)典的Notch信號(hào)通路。前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路可激活MAPK［30-31］，且MAPK通路與細(xì)胞增殖密切相關(guān)［32-33］，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了MAPK通路下游蛋白變化情況，Western Blot結(jié)果顯示，過表達(dá)CCN3能夠促進(jìn)ERK1+2以及p-ERK1+2蛋白表達(dá)，這提示CCN3可能通過上調(diào)MAPK信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)Notch分泌型配體CCN3在MEFs增殖和凋亡中的作用和機(jī)制進(jìn)行了初步探討，研究結(jié)果顯示CCN3可能與Notch1結(jié)合，通過抑制DLL1/Notch信號(hào)通路，激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，從而有效增加細(xì)胞數(shù)量。本結(jié)果提示CCN3有望作為MSCs的有效促增殖因子應(yīng)用于骨組織工程中。但在骨組織工程中，如何合理使用CCN3，與骨形成蛋白BMPs、骨支架等協(xié)同作用，促進(jìn)骨損傷部位骨再生，尚需進(jìn)一步研究。