連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的機制：基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術

鄢海燕，鄒純才

皖南醫(yī)學院藥學院，安徽 蕪湖 241002

中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委辦公廳和中華人民共和國國家中醫(yī)藥管理局辦公室發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（試行第七版）（國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕184號）［1］明確新型冠狀肺炎（COVID-19）臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳和乏力。在中醫(yī)治療中，明確COVID-19屬于中醫(yī)“疫”病范疇，病因為感受“疫戾”之氣，各地可根據(jù)病情、當?shù)貧夂蛱攸c以及不同體質情況進行辯證論治，并推薦連花清瘟膠囊用于醫(yī)學觀察期的治療。

Hu等［2］的最新研究論文闡述了連花清瘟膠囊用于臨床治療COVID-19的療效，即經(jīng)過連花清瘟治療組治療14 d（4粒/次，3次/d）后，連花清瘟膠囊治療組的恢復率達91.5%，明顯高于對照組（82.4%），且連花清瘟膠囊治療組對于發(fā)熱、乏力、咳嗽等癥狀的治愈時間中位數(shù)明顯縮短。該文認為，從安全性和有效性角度來看，可以考慮使用連花清瘟膠囊改善COVID-19的臨床癥狀（發(fā)熱、干咳和乏力）。

以系統(tǒng)生物學理論為基礎的網(wǎng)絡藥理學，通過對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡分析來選取特定信號節(jié)點，構建活性成分-蛋白靶點-信號通路之間的復雜網(wǎng)絡來探討藥物的作用機制。現(xiàn)有網(wǎng)絡藥理學研究多關注藥物作用于靶點蛋白用于疾病的治療［3-4］，對于疾病與其臨床癥狀共有靶點蛋白間的網(wǎng)絡藥理學研究少有報道。COVID-19的臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳和乏力。涉及發(fā)熱、干咳和乏力等臨床癥狀的靶點蛋白較多，就COVID-19而言，這些臨床癥狀似應與COVID-19間存在共有的靶點蛋白。連花清瘟膠囊改善COVID-19的臨床癥狀提高臨床治愈率似應是作用于COVID-19及其臨床癥狀（發(fā)熱、干咳和乏力）共有靶點蛋白的結果。為此，為更全面地研究連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的機制和物質基礎，本文以“fever”、“coughing ”、“fatigue ”等臨床表現(xiàn)及“2019-nCoV”、“COVID-19”為疾病關鍵詞，篩選出“fever”、“coughing ”、“fatigue ”、“2019-nCoV”、“COVID-19”中的共同靶點蛋白。同時選取連花清瘟膠囊中連翹、金銀花等13味中藥，對涉及到的活性成分進行篩選，通過網(wǎng)絡藥理學方法研究連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的潛在作用靶點和信號通路及生物學過程，并采用分子對接技術研究核心活性成分與主要通路中的靶點蛋白的對接，探討連花清瘟膠囊提高COVID-19臨床治愈率的機制和物質基礎。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)資料來源

1.1.1 藥材來源 連花清瘟膠囊（國藥準字Z20040063）由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。成分為：連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草。功能主治為清瘟解毒、宣肺泄熱。用于治療流行性感冒屬熱毒襲肺證，癥見：發(fā)熱或高熱，惡寒，肌肉酸痛，鼻塞流涕，咳嗽，頭痛，咽干咽痛，舌偏紅，苔黃或黃膩等。

1.1.2 活性成分來源 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https://tcmspw.com/tcmsp.php)及有關文獻［5］，分別以連花清瘟膠囊中的13味藥來檢索活性成分，其中炙麻黃、炒苦杏仁、綿馬貫眾分別按麻黃、苦杏仁、貫眾進行檢索。選擇符合口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、類藥性（drug like,DL）≥0.18并合并各藥味中相同的活性成分，繪制結構式并以MDL SDfile（*.sdf）格式保存（檢索日期：2020年10月28日）。將這些活性成分的MDL SDfile（*.sdf）格式結構式導入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），檢索符合Probability≥0.1的活性成分靶點蛋白（檢索日期：2020年11月2日）。

1.1.3 候選靶標來源 利用CooLGeN(http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php)、GeneCards（https://www.genecards.org/） 、TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）數(shù)據(jù)庫，以“fever”、“coughing ”、“fatigue ”、“2019-nCoV”、“COVID-19”為關鍵詞，收集臨床表現(xiàn)及疾病靶點蛋白（選擇標示符為All human genes），篩選臨床表現(xiàn)與疾病共有靶點蛋白，再進一步選擇與藥材中活性成分相匹配的靶點蛋白。

1.2 靶點通路及生物學功能注釋分析

將靶點蛋白復制至DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）的列表中，選擇標示符為official_gene_symbol，物種注釋為Homo sapiens，進行靶點蛋白的GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）_PATHWAY通路注釋分析。

1.3 活性成分-蛋白靶點-生物學功能網(wǎng)絡分析和構建

根據(jù)預測結果，使用Gephi0.9.2軟件將篩選出來的活性成分、蛋白靶點和生物學功能構建活性成分-蛋白靶點-生物學功能網(wǎng)絡。

1.4 分子對接分析

本文以SYBYL-X 2.1.1對接軟件對靶點蛋白和化學成分進行分子對接分析，獲得Total Score值。

2 結果

2.1 連花清瘟膠囊各藥味中活性成分

通過TCMSP及有關文獻［5］共檢索到連花清瘟膠囊各藥味中符合OB≥30%、DL≥0.18的活性成分（合并各藥味中相同的活性成分）210個。

2.2 靶點的預測

將“2.1”中符合OB≥30%、DL≥0.18的活性成分以MDL SDfile（*.sdf）格式導入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白靶點信息24215條，涉及1320個化學靶點蛋白。篩選符合Probability≥0.1的活性成分靶點蛋白，獲得蛋白靶點信息12274條，涉及1159個化學靶點蛋白。

利用CooLGeN、GeneCards、TTD數(shù)據(jù)庫，以“2019-nCoV”、“COVID-19”為關鍵詞，共收集疾病靶點蛋白（All human genes）261個（檢索日期：2020年10月28日）。以“fever”、“coughing ”、“fatigue”為關鍵詞，分別收集疾病臨床表現(xiàn)靶點蛋白7237、4157、7127個?！癴ever”、“coughing”、“fatigue”與COVID-19的共有靶點蛋白分別為154、176、106個。篩選各藥材中與“fever”、“coughing”、“fatigue”與COVID-19的共有靶點蛋白相同的靶點蛋白及對應的化學成分。并進一步確定藥材、臨床表現(xiàn)及COVID-19中共同的靶點蛋白共計57個（圖1）。

活性成分與COVID-19及其臨床表現(xiàn)（發(fā)熱、咳嗽、乏力）的共有靶點蛋白共計57個：ABL1、ACE、ACE2、AGTR1、AKT1、ALK、AR、BTK、CALCA、CASP1、CASP3、CCL2、CCR5、CTSL、CXCL8、DHODH、DPP4、EGFR、FLT3、G6PD、HPSE、HSP90AA1、HSPA5、IDH1、IL2、IL6、JAK1、JAK2、LNPEP、MAPK1、MCL1、MGMT、MPO、MTOR、NFKB1、NLRP3、NR3C1、P2RX7、PARP1、PIK3CG、PLAT、PLAUR、PLG、PPARA、REN、ROS1、TK1、TLR4、TLR7、TLR9、TNF、TRPV1、TRPV4、TTR、VCP、VEGFA、XPO1，涉及11味藥、160個活性成分（注：本文活性成分均以Mol ID表示，具體成分名稱可檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫）。藥材、化學成分及靶點蛋白信息（以 MAPK1、NLRP3、HSP90AA1、TLR9、AKT為代表）：

AKT1靶點蛋白：MOL000006（金銀花、連翹、炙麻黃），MOL000098（甘草、廣藿香、金銀花、連翹、魚腥草、炙麻黃），MOL000239、MOL000354、MOL004828、MOL004863、 MOL004866、 MOL004891、MOL004904、MOL004949、MOL004961（甘 草），MOL000422（甘草、金銀花、連翹、綿馬貫眾、魚腥草、炙麻黃），MOL001495、MOL003044、MOL003117（金銀花），MOL001735（板藍根），MOL002235（大黃），MOL002823、MOL002881、MOL005842（炙麻黃）；

HSP90AA1靶點蛋白：MOL000500、MOL004806、MOL004838、 MOL004849、 MOL004855、MOL004856、 MOL004857、 MOL004863、MOL004864、 MOL004883、 MOL004884、MOL004904、 MOL004905、 MOL004910、MOL004911、 MOL004935、 MOL004945、MOL004949、 MOL004959、 MOL004980、MOL004988、 MOL004989、 MOL005001、MOL005008、（甘草），MOL001040（綿馬貫眾），MOL002311、MOL004908（甘 草 、苦 杏 仁），MOL003283、MOL003370（連翹），MOL005016（甘草、廣藿香）；

MAPK1靶點蛋白：MOL000522、MOL003283、MOL003330、MOL003370（連 翹），MOL001728、MOL001774、MOL001803（板藍根），MOL004806、MOL004808、 MOL004838、 MOL004891、MOL004905、MOL004959、MOL004988、MOL004989（甘草），MOL004908（甘草、苦杏仁），MOL005911（廣藿香）；

NLRP3靶點蛋白：MOL001495（金銀花），MOL001494（金銀花、炙麻黃）；

TLR9 靶 點 蛋 白 ：MOL000392、MOL000417、MOL002844、 MOL004815、 MOL004833、MOL004879、 MOL004885、 MOL004891、MOL004907、MOL004957、MOL004990、MOL005016（甘草），MOL001728、MOL001749（板藍根），MOL004908（甘草、苦杏仁）。

2.3 靶點信號通路與Gene Ontology（GO）分析

將連花清瘟膠囊中各藥味活性成分與COVID-19及其臨床表現(xiàn)（發(fā)熱、咳嗽、乏力）共有的57個靶點蛋白導入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行靶點蛋白的GOTERM_BP_DIRECT、 GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析和KEGG_PATHWAY通路注釋分析。信號通路主要涉及NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、Renin-angiotensin system等35條信號通路。其中Benjamini correction＜0.01的信號通路共有10條（圖2）。

圖2 連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點的KEGG信號通路富集分析Fig.2 Enrichment analysis of KEGG signal pathway of potential targets of the active components in Lianhua Qingwen capsule.

連花清瘟膠囊中的160個活性成分通過MAPK1，IL6，HSP90AA1，TNF，CCL2，NFKB1，CASP1，NLRP3等靶點蛋白參與COVID-19及其臨床表現(xiàn)（發(fā)熱、咳嗽、乏力）的生物過程、細胞組成和分子功能。生物過程主要與regulation of apoptosis、regulation of programmed cell death等有關，細胞組成主要與cell surface、extracellular space等有關，分子功能主要與protein tyrosine kinase activity、ATP binding等有關（圖3、4）。

圖3 連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點與COVID-19及其臨床表現(xiàn)（發(fā)熱、咳嗽、乏力）相關的GOTERM_BP_FAT富集分析Fig.3 GOTERM_BP_FAT enrichment analysis of the potential targets of active components in Lianhua Qingwen capsule and the biological functions related to COVID-19 and its clinical manifestations(fever,cough,and fatigue)(Benjamini correction≤0.0001).

圖4 連花清瘟膠囊中活性成分潛在靶點與COVID-19及其臨床表現(xiàn)（發(fā)熱、咳嗽、乏力）相關的富集分析Fig.4 GOTERM_CC_FAT(A)and GOTERM_MF_FAT(B)enrichment analysis of the potential target of active components in Lianhua Qingwen capsule and the biological function related to COVID-19 and its clinical manifestations(fever,cough,fatigue)(Benjamini correction≤0.01).

2.4 活性成分-靶點蛋白-信號通路網(wǎng)絡的構建

使用Gephi 0.9.2軟件構建化學成分-靶點蛋白-信號通路網(wǎng)絡。連花清瘟膠囊中的160個活性成分通過57個靶點蛋白、35條信號通路發(fā)揮治療COVID-19或干預COVID-19病變過程的作用，網(wǎng)絡關系復雜、蛋白靶點與信號通路多（圖5）。

圖5 連花清瘟膠囊中藥味-部分活性成分-靶點蛋白-作用通路網(wǎng)絡圖Fig.5 Network diagram of medicinal ingredients()-active component()-target protein()-action pathway()in Lianhua Qingwen capsule.

2.5 部分活性成分與靶點蛋白分子對接結果分析

鑒于 NOD-like receptor signaling pathway、Tolllike receptor signaling pathway的Benjamini correction較小，為5.8E-5、1.5E-6。為此，以NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway涉及的靶點蛋白MAPK1（PDB ID:6SLG）、IL6（PDB ID:1ALU）、HSP90AA1（PDB ID:3O0I）、TNF（PDB ID:6M95）、CCL2（PDB ID:5J5Y）、NFKB1（PDB ID:1LE9）、CASP1（PDB ID:1RWV）、NLRP3（PDB ID:3VWE）、PIK3CG（PDB ID:2A4Z）、AKT1（PDB ID:4GAH）、TLR4（PDB ID:3FXI）、TLR7（PDB ID:5T1S）、TLR9（PDB ID:5WYX）為例，對靶點蛋白和化學成分進行分子對接結果分析，驗證連花清瘟膠囊化學成分與靶點蛋白的作用。配體與受體間低能量的穩(wěn)定構象預示著二者間有較大的作用可能性。一般以結合能≤-5kJ/mol或Total Score值≥5.0作為篩選標準。本文以SYBYL-X 2.1.1對接軟件進行分子對接，獲得Total Score值（表1）。分子對接結果表明，MOL000522、MOL001495、MOL001494等83個化學成分與MAPK1、IL6、HSP90AA1等 12個靶點蛋白的 Total Score值≥5.0。Total Score值≥9.0的代表性核心活性成分與靶點蛋白分子對接模式（圖6）。

圖6 代表性核心活性成分與靶點蛋白分子對接模式Fig.6 Molecular docking mode of representative core active components and target proteins(Total Score≥9.0).

表1 NOD-like and Toll-like receptor signaling pathway各化學成分與靶點蛋白作用的Total Score值Tab.1 Total score values of each chemical component interacting with target protein in NOD like and total like receptor signaling pathway

續(xù)表1-2

續(xù)表1-3

3 討論

通過網(wǎng)絡藥理學研究連花清瘟膠囊與COVID-19的臨床表現(xiàn)（“fever”、“coughing”、“fatigue”）關系結果可知，在涉及到的35條信號通路中，Benjamini correction最小的2個信號通路為NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway，Benjamini correction分別為5.8E-5、1.5E-6。NOD受體可識別進入細胞內的病原微生物及其產(chǎn)物，快速啟動信號傳遞，激活天然免疫效應機制；Toll受體可識別細胞外病原體，并將信號傳遞至細胞內激發(fā)機體天然免疫系統(tǒng)。二種模式識別受體可獨立進行自我辨識，同時又相互聯(lián)系協(xié)調，在啟動天然免疫反應中共同發(fā)揮重要作用，可激活免疫系統(tǒng)，破壞免疫耐受狀態(tài)，糾正自身免疫性疾?。?-7］。連花清瘟膠囊提高COVID-19的臨床治愈率可能主要與提高患者自身免疫能力、抑制炎癥反應有關。為此，以NOD-like receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway涉及的靶點蛋白及其化學成分進行了分子對接結果分析，驗證連花清瘟膠囊化學成分與靶點蛋白的作用。MOL000522、MOL001495、MOL001494等83個化學成分與MAPK1、IL6、HSP90AA1等12個靶點蛋白的Total Score值≥5.0，Total Score值≥9.0涉及到的主要靶點蛋白有MAPK1、NLRP3、HSP90AA1、TLR9、AKT1。

MAPK可調節(jié)細胞增殖、分化、死亡、應激反應和凋亡等關鍵細胞活動［8］，在細胞生命中起著重要作用［9］。MAPK1是多種生化信號的整合點，參與細胞增殖分化、轉錄調控和細胞的有絲分裂自噬等多種生物學過程，在治療各種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，也是急性肺損傷（ALI）炎癥反應和LPS誘導的細胞損傷的重要調節(jié)因子［10-14］。由本文網(wǎng)絡藥理學和分子對接結果可知，來自連翹、甘草、板藍根、苦杏仁、廣藿香的14個化學成分與MAPK1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞5.0，其中 MOL000522（連翹）、MOL004989（甘草）、MOL003330（連翹）與MAPK1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞9.0。連花清瘟膠囊作用于MAPK1靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控等生物學途徑，提高患者自身免疫能力、抑制炎癥反應發(fā)揮提高COVID-19臨床治愈率作用。

NLRP3炎癥小體作為機體固有免疫及應激系統(tǒng)的重要防御成分，不但可以識別細菌、病毒等病原體引發(fā)機體發(fā)生固有免疫應答，還負責炎癥反應的激活［15-17］，參與了多種疾病發(fā)生和進展［18］，在先天免疫中起著重要作用［19］。近年來，愈來愈多的研究表明NLRP3炎性體在肺部感染性疾病中參與并發(fā)揮多種作用［20］。如在各種類型ALI中介導了炎癥介質的生成和炎癥細胞的浸潤，增加肺泡上皮細胞的通透性，促進肺水腫的形成［21］。抑制或缺失NLRP3可特異性減輕輻射和脂多糖治療引起的小鼠肺部炎癥［22］。中藥成分也可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，繼而減輕脂多糖誘導的ALI［23-25］。由本文網(wǎng)絡藥理學和分子對接結果可知，MOL001494（金銀花、炙麻黃）、MOL001495（金銀花）與NLRP3靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞9.0。連花清瘟膠囊作用于NLRP3靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控等生物學途徑，提高機體固有免疫及應激功能，激活并參與炎癥反應，在提高COVID-19臨床治愈率中發(fā)揮重要作用。

作為鳥流感病毒結合受體的細胞表面蛋白HSP90AA1在感染早期通過HSP90AA1-AKT-MTOR途徑誘導自噬。一旦病毒識別，HSP90AA1和AKTMTOR通路的直接連接會觸發(fā)自噬，這是控制感染的關鍵步驟［26］。由本文網(wǎng)絡藥理學和分子對接結果可知，來自連翹、甘草、苦杏仁、廣藿香、綿馬貫眾的30個化學成分與HSP90AA1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞5.0，其中MOL004908（甘草、苦杏仁）、MOL004863、MOL004806（甘草）與HSP90AA1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞9.0。連花清瘟膠囊作用于HSP90AA1靶點蛋白，可能通過對有機物的反應、細胞生物合成過程的正調控等生物學途徑，觸發(fā)自噬控制病毒感染，在提高COVID-19臨床治愈率中發(fā)揮重要作用。

TLR9可激活固有免疫系統(tǒng)，參與傳染病檢測［27-28］。TLR9和磷脂酰肌醇-3-激酶γ（PI3Kγ）是免疫應答中非常重要的效應因子。免疫應答需要PI3Kγ，其中TLR9是相關的觸發(fā)因子［29-30］。在穩(wěn)態(tài)條件下，不適當?shù)腡LR9反應可導致嚴重的自體炎癥性疾病，阻斷TLR9炎癥通路被激活，控制疾病進展和炎癥并發(fā)癥［31］。在肺缺血再灌注過程中釋放的線粒體DNA（mtDNA）會觸發(fā)TLR9依賴性網(wǎng)絡的形成，并導致肺損傷［32］。由本文網(wǎng)絡藥理學和分子對接結果可知，來自板藍根、甘草、苦杏仁的14個化學成分與TLR9靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞5.0，其中MOL001749（板藍根）與TLR9靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞9.0。連花清瘟膠囊作用于TLR9靶點蛋白，可能通過對傷害的反應、細胞因子產(chǎn)生的調節(jié)、細胞生物合成過程的正調控等生物學途徑，激活固有免疫系統(tǒng)，在預防疾病進展和炎癥并發(fā)癥的發(fā)展中起到作用［31］，提高COVID-19臨床治愈率。

AKT1是調節(jié)細胞存活的信號通路中的一個中心節(jié)點。AKT1調控的多種途徑在細胞內通過100多種細胞底物的磷酸化進行溝通［33］。如肺纖維化和高碳酸血癥。特發(fā)性肺纖維化是一種進行性間質性肺炎，以成纖維細胞聚集、膠原沉積和細胞外基質重塑為特征。AKT1通過誘導巨噬細胞產(chǎn)生IL-13來調節(jié)肺纖維化，表明靶向AKT1可能同時阻斷特發(fā)性肺纖維化的纖維化過程［34］。高碳酸血癥是嚴重急性和慢性肺部疾病患者死亡的危險因素。靶向AKT1或升高CO2信號的下游通路可以增強巨噬細胞抗病毒宿主的防御能力，并改善晚期肺部疾病高碳酸血癥患者的臨床預后［35］。由本文網(wǎng)絡藥理學和分子對接結果可知，來自甘草、金銀花、連翹、綿馬貫眾、魚腥草、炙麻黃、廣藿香、金銀花、板藍根、大黃的18個化學成分與AKT1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞5.0，其中MOL001495（金銀花）與AKT1靶點蛋白的分子對接結果Total Score值＞9.0。連花清瘟膠囊作用于AKT1靶點蛋白，可能通過細胞凋亡調控、細胞程序性死亡的調控、細胞死亡調控、多細胞生物過程的正調控等生物學途徑，在提高COVID-19臨床治愈率中發(fā)揮重要作用。

COVID-19屬中醫(yī)肺絡病，其臨床病理特征是免疫系統(tǒng)功能障礙和炎癥反應引起的深氣道、肺泡的損害，還可見重度肺充血。連花清溫膠囊以絡病理論為指導，對許多病毒如sars-CoV、mers-CoV和炎癥反應有抑制作用，已納入國家的COVID-19診斷和治療計劃，其理論組方特色和臨床基礎研究已得到廣泛認可，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的代表性藥物［36］。最新研究表明［36］，連花清瘟膠囊可抑制體外培養(yǎng)的COVID-19活性，顯著緩解COVID-19患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力等癥狀，為連花清瘟膠囊治療COVID-19提供了理論和臨床依據(jù)。