結(jié)合GC-MS和GC-IMS分析不同處理方式下青豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

馮 濤，孫嘉卿，張 燦，張康逸?

（1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

青豆又稱豌豆、荷蘭豆、雪豆，青綠色，干后變?yōu)辄S色。富含鈣、維生素 A、胡蘿卜素、鉀以及人體需要的多種氨基酸，對增強(qiáng)人體新陳代謝功能有十分重要的作用[1]。青豆還有益脾健胃、生津止渴、和中下氣等作用，經(jīng)常食用，對脾胃虛弱、小腹?jié)M脹、煩熱口渴等癥狀均有療效，且一般人群均可食用[2]。由于青豆原料豐富、價(jià)格低廉、易于加工、貯藏和運(yùn)輸，因此在國內(nèi)外市場十分暢銷[3]。除了本幫特色菜中的青豆、青豆醬罐頭、花椒青果粥[4]等產(chǎn)品，隨著人民生活水平的不斷提高以及人們的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化，人們對鮮食青豆的需求逐漸從單一型向多元型轉(zhuǎn)變[5]。傳統(tǒng)發(fā)酵[6]、混菌發(fā)酵[7]等開始進(jìn)入人們視線。目前青豆加工業(yè)開發(fā)深度還不夠，對青豆的研究較為單一，主要是營養(yǎng)[8]及品質(zhì)分析[9]，針對不同的處理方式產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)的對比分析研究較少。主要瓶頸被認(rèn)為是豆類產(chǎn)品加工中所產(chǎn)生的青豆腥味[10]。從理論上闡明不同加工方式對青豆風(fēng)味的影響和主要風(fēng)味物質(zhì)的組成和變化規(guī)律對指導(dǎo)青豆產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

氣相色譜-離子遷移譜法（GC-IMS）是近年來在新興技術(shù)領(lǐng)域興起的熱度較高的氣相分離檢測技術(shù)[11]，該技術(shù)結(jié)合了氣相色譜的高分離能力和離子遷移率光譜（IMS）的快速響應(yīng)、高靈敏度、大氣壓下室溫下即可進(jìn)行、無需進(jìn)行預(yù)處理即可提供快速分析，和可變體積進(jìn)樣的優(yōu)點(diǎn)，又彌補(bǔ)了氣相色譜的低鑒別能力[12]。在食品檢測、鑒別[13]、溯源、分級[14]等各個(gè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。但是將GC-IMS技術(shù)用來表征不同處理方式下的青豆揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜的研究尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用的青豆采摘時(shí)間、采摘成熟度相似，保存方法為冷藏。其不同處理方式見下表1。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec?風(fēng)味分析儀、GC-MS(5975C-7890 A)氣質(zhì)聯(lián)用儀、G4513A16位自動(dòng)進(jìn)樣塔：美國安捷倫科技有限公司；50/20 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國色譜科公司；MP5002電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；2-辛醇：上海源葉生物科技有限公司。

表1 青豆樣品Table 1 Green bean sample

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GC-IMS測定條件

頂空進(jìn)樣條件：頂空孵化溫度：40 ℃；孵化時(shí)間：15 min；頂空進(jìn)樣針溫度：45 ℃；進(jìn)樣量：500 μL；孵化轉(zhuǎn)速：500 rpm。

GC-IMS條件：色譜柱類型：FS-SE-54-CB-1 15 m ID:0.53 mm；柱溫：60 ℃；漂移氣（高純N2，純度≥99.999%）；流速：150 mL/min；IMS探測器溫度：45 ℃。

樣品前處理：稱取2 g樣品，置于20 mL頂空瓶中，40 ℃孵育15 min后進(jìn)樣。

1.3.2 GC-MS測定條件

樣品前處理：稱取不同處理的青豆樣品各6 g，置于30 mL棕色螺口固相微萃取樣品瓶中，放入80 ℃恒溫水浴鍋中平衡20 min；同時(shí)，將固相微萃取頭插入GC-MS儀的進(jìn)樣口中，在250 ℃條件下老化20 min。然后再將萃取頭插入平衡好的樣品瓶中，在80 ℃恒溫水浴條件下吸附50 min后取出，插入氣相色譜進(jìn)樣口，解吸6 min。

1.3.3 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜毛細(xì)管柱為DB-5MS(60 mm×0.32 mm，1 μm)；色譜柱起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的升溫速率升至180 ℃，再以10 ℃/min的升溫速率升至250 ℃，并保持10 min。載氣為氦氣，載氣流量為0.8 mL/min，壓力為3.29×104Pa，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，運(yùn)行時(shí)間47 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(electron impact，IE)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍為35～450 m/z，溶劑延遲3 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用功能軟件 Laboratory Analytical Viewer和分析軟件和三款插件 Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA以及GC×IMS Library Search對圖譜進(jìn)行差異分析，通過內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S的IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫二維定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-IMS檢測下不同處理方式青豆樣品中的風(fēng)味差異

不同處理方式的青豆樣品揮發(fā)性物質(zhì)GC-IMS圖譜見圖1，縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時(shí)間，橫坐標(biāo)代表離子遷移時(shí)間，橫坐標(biāo) 1.0處豎線為 RIP峰（反應(yīng)離子峰，經(jīng)歸一化處理）。RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色越深表示濃度越大[15]。結(jié)合以上說明及GC-IMS二維俯視圖可以對不同樣品之間的揮發(fā)性物質(zhì)組成進(jìn)行直觀比較。與對照青豆相比，預(yù)冷青豆樣品的風(fēng)味譜圖和其較為相似，風(fēng)味物質(zhì)濃度相差不大；譜圖較為相似的漂燙、清洗、速凍三種處理方式下的青豆樣品有了變化，少數(shù)風(fēng)味物質(zhì)濃度有所增加，但對風(fēng)味的影響相對較小，蒸、煮、凍干處理后的青豆風(fēng)味物質(zhì)明顯減少，變化較為明顯；炒制樣品的譜圖中，揮發(fā)性物質(zhì)種類最為豐富、與其他處理方式的青豆差異最大，最為明顯。

圖1 不同處理方式的青豆樣品揮發(fā)性物質(zhì)成分二維譜圖（俯視圖）Fig.1 Two dimensional spectrum of volatile compounds in green beans samples with different treatment methods (top view)

2.2 GC-IMS檢測下不同處理方式青豆樣品風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜對比

為了更具體直觀表現(xiàn)不同樣品、不同過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律和相對含量的比較，我們借助 Gallery Plot插件來繪制揮發(fā)性物質(zhì)的指紋譜圖，直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異。

圖 2中每一行代表一個(gè)樣品中選取的全部信號峰，圖中每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的信號峰。從圖中可以看出每種樣品的完整揮發(fā)性有機(jī)物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物的差異。不同樣品的風(fēng)味物質(zhì)變化在Gallery Plot指紋譜圖更加明顯，每一列是不同樣品中的一種風(fēng)味物質(zhì)，顏色深淺代表濃度高低，通過縱向的比較，不同風(fēng)味物質(zhì)濃度呈現(xiàn)一定的規(guī)律，非常直觀。青豆中部分風(fēng)味物質(zhì)未準(zhǔn)確定性，我們以阿拉伯?dāng)?shù)字順序編號并放于最后。主要對已準(zhǔn)確定性的40種揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，我們把這些物質(zhì)按照醇、醛、酮等進(jìn)行分類，相同種類的物質(zhì)放在一起，以便分析不同加工過程中，樣品中的風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律。

如圖2A框可以看到，在不同處理方式下青豆中醇類物質(zhì)含量較多，如1-辛烯-3-醇、2-丙醇、戊醇等，在對照、速凍、清洗、漂燙、預(yù)冷的操作工藝下含量最多，尤其是清洗工藝下，在炒制和凍干的處理工藝下醇類物質(zhì)明顯減少。如圖2B框所示，醛類物質(zhì)如壬醛、反-2-己烯醛、辛醛等物質(zhì)在速凍青豆樣品中濃度最高，其次是蒸煮的處理方式。如圖2C框所示，酮類物質(zhì)如2-庚酮、3-羥基-2-丁酮等在經(jīng)炒制凍干處理后含量有較大的提高。如圖2D框所示，乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯等酯類物質(zhì)在速凍處理中含量最多，經(jīng)蒸、煮、炒制、凍干處理后較少。

2.3 GC-MS 和GC-IMS兩種不同檢測方式下不同處理方式青豆樣品風(fēng)味物質(zhì)對比

表2，3分別為GC-IMS和GC-MS所分析出的9種不同處理方式下的青豆的主要風(fēng)味物質(zhì)。

圖2 不同處理方式的青豆樣品Gallery Plot指紋譜圖Fig.2 Gallery plot fingerprint of green beans samples with different treatment methods

表2 G C-IMS分析顯示9種不同處理方式下的青豆揮發(fā)性物質(zhì)峰面積Table 2 Peak area of volatile compounds of green beans under 9 different treating methods via GC-IMS

續(xù)表2

表3 G C-MS分析顯示不同處理方式下的青豆主要風(fēng)味物質(zhì)的相對含量（相對內(nèi)標(biāo)物2-辛醇的濃度）Table 3 GC-MS analysis shows the relative content of main flavor compounds(relative internal standard n-octanol concentration) in different treatment methods %

續(xù)表3

通過對比分析不同處理方式下青豆的共有風(fēng)味物質(zhì)，由圖3韋恩圖發(fā)現(xiàn)，GC-MS和GC-IMS共同檢測出的風(fēng)味物質(zhì)一般為5～7種，多為壬醛、1-辛烯-3-醇、正己醛、苯甲醛、甲基庚烯酮、反-2-辛烯醛、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、苯乙烯等化合物，推測其為青豆的主要風(fēng)味物質(zhì)。具體的：正己醛、苯甲醛、壬醛、1-辛烯-3-醇為九種不同處理方式下兩種不同檢測方法均共有的風(fēng)味物質(zhì)；預(yù)冷和凍干青豆中兩種檢測方法共同檢出的風(fēng)味物質(zhì)還有苯乙烯；對照、清洗、預(yù)冷青豆在兩種檢測方法下均檢測到甲基庚烯酮，與GC-IMS單獨(dú)檢測結(jié)果中經(jīng)凍干處理后酮類物質(zhì)含量增加的結(jié)果較為一致，除對照、清洗青豆外，其他處理方式在兩種不同檢測方式下得共有化合物還有反-2-辛烯醛，與本研究GC-IMS單獨(dú)檢測中對照青豆醛類物質(zhì)含量最低結(jié)果一致，說明在經(jīng)過加工處理后的青豆醛類物質(zhì)和種類的含量都會(huì)增加。而炒制后的青豆在兩種檢測方式下的獨(dú)有化合物為烘烤風(fēng)味較重的 2-乙基-3，5-二甲基吡嗪，也表明其為炒制青豆的特征風(fēng)味，作為典型的油脂氧化產(chǎn)物，其香氣特征為豆香和蔬菜樣[16]。在GC-MS檢測結(jié)果中，2-甲基-6-乙烯基吡嗪、3-乙基-2，5-甲基吡嗪等雜環(huán)化合物產(chǎn)生，且 3-乙基-2，5-甲基吡嗪、2，5-二甲基-3-(3-甲基丁基)吡嗪的百分含量較高?？芍s環(huán)類化合物對炒制青豆風(fēng)味的影響較大。

圖3 不同處理方式下GC-MS和GC-IMS的風(fēng)味韋恩圖Fig.3 Venn diagram of flavor of GC-MS and gc-ims under different treatment methods

在 GC-MS分析出的風(fēng)味物質(zhì)中，結(jié)合表 4的OAV值，得出以下結(jié)論。

醛類中，速凍青豆的醛類化合物種類最多且每種OAV值較高，其次是預(yù)冷和蒸煮。以在兩種檢測方式檢測重合性較高的正己醛、苯甲醛為例，除速凍、預(yù)冷和蒸煮之外的工藝處理下其醛類物質(zhì)種類及含量都明顯較少，這與本研究指紋圖譜中的結(jié)論基本一致。在對玉米不同處理方式對風(fēng)味影響的研究中，我們發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)主要在蒸煮過程中大量生成，而對于青豆，其在溫度較低的速凍以及預(yù)冷的處理方式下醛類物質(zhì)含量和種類也較多，該類成分被認(rèn)為主要是不飽和脂肪酸的自動(dòng)氧化和水解的產(chǎn)物[17]。

酮類一般被認(rèn)為呈脂香和焦香香氣，并且隨著碳鏈增長呈現(xiàn)出增強(qiáng)的花香氣息。在凍干處理下較明顯的產(chǎn)生了 3，5-辛二烯酮、beta-紫羅蘭酮等酮類物質(zhì)。該酮類物質(zhì)是由于類胡蘿卜素（植物烯或植物氟烯）發(fā)生氧化反應(yīng)和縮合反應(yīng)而生成的[18]。

醇類中，以1-辛烯-3-醇為例，很明顯經(jīng)過蒸煮以及炒制處理后，青豆中醇類物質(zhì)的含量驟減。這可能來源于脂氧合酶對部分脂肪酸的氧化作用、醇脫氫酶對部分醛類物質(zhì)的還原作用、酯類物質(zhì)水解反應(yīng)的結(jié)果。酯類物質(zhì)是脂肪氧化產(chǎn)生的游離脂肪酸和醇相互作用形成的，由于對香氣貢獻(xiàn)不大，OAV值較小且差異不明顯，己酸甲酯、苯甲酸甲酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯等雖然相對含量較少，但在不同種處理方式中均有發(fā)現(xiàn)，后續(xù)可考慮香氣重組缺失實(shí)驗(yàn)對其香氣貢獻(xiàn)值進(jìn)行更細(xì)致的評估，故未在表中列出。

表4 G C-MS檢測下9中不同處理方式的青豆OAV值大于3的風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Flavor compounds with OAV value greater than 3 detected by GC-MS

綜上，可以根據(jù)不同種化合物的總體含量初步對青豆的處理方式進(jìn)行判斷。

2.4 不同處理方式下青豆樣品的香氣輪廓圖

對9種不同處理方式下的青豆中OAV值大于100的風(fēng)味化合物結(jié)合其風(fēng)味特征，采用八個(gè)感官描述詞來評價(jià)其香氣：綠色脂肪、苦杏仁樣、玫瑰甜香、蠟狀醛香、蘑菇干草香、柑橘果香、蔬菜青香、辛辣干柏油，在OAV值相差不大的情況下按照相對含量建立表5，并繪制香氣輪廓圖。

從圖4中可以看出，經(jīng)不同方式處理的青豆在蠟狀醛香的香氣方向比較接近，且均以蠟狀醛香和脂肪青香為主。蠟狀醛香主要由3，5-辛二烯酮、反-2-癸烯醛、壬醛、癸醛、反-2-己烯醛等醛酮類化合物貢獻(xiàn)，脂肪青香主要是因?yàn)檎喝?E)-2-庚烯醛、庚醛、(E，E)-2，4-壬二烯醛、反-2-辛烯醛等所帶來。其中正己醛被認(rèn)為是豆腥味的典型代表，是亞油酸在脂肪氧合酶作用下發(fā)生酶促反應(yīng)裂解后產(chǎn)生的[19]。

表5 九種青豆八個(gè)香氣描述詞的相對含量Table 5 Relative contents of eight aroma descriptors of nine Maize Species %

其中，對照、漂燙、清洗青豆的風(fēng)味輪廓圖較為相似，依舊以蠟狀醛香為主，且含量有所增加，考慮到是加工過程中醛類物質(zhì)增加所致；綠色脂肪、蘑菇干草、以及蔬菜的青香有所增加，貢獻(xiàn)相當(dāng)，考慮到主要是2-正戊基呋喃等化合物含量增加所致，而2-正戊基呋喃是食品熱加工中美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物[20]。與上文 OAV值的變化趨勢一致。也有相關(guān)研究將2-戊基呋喃定義為青豆味[21]，可見其對青豆特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。速凍和預(yù)冷的青豆風(fēng)味輪廓較為相似，但經(jīng)預(yù)冷處理后風(fēng)味物質(zhì)含量較高，依舊是蠟狀醛香為主。經(jīng)蒸煮工藝后蘑菇干草香有減少的趨勢，考慮到是1-辛烯-3-醇等醇類物質(zhì)較少所致。經(jīng)凍干處理后青豆中的柑橘果香風(fēng)味有所增加，主要是受甲苯、己酸甲酯、(+)-檸檬烯、2-十一烯醛等化合物的影響。炒玉米中由苯甲醛帶來的苦杏仁、堅(jiān)果香的香氣較明顯[22]，且蠟狀醛香有明顯的減少，與本研究炒制工藝導(dǎo)致醛類物質(zhì)減少的結(jié)論一致。

圖4 9 種青豆樣品的香氣輪廓圖Fig.4 Aroma profile of 9 green beans samples

3 結(jié)論

在對速凍、清洗、漂染、預(yù)冷、蒸、煮、炒、凍干以及對照青豆通過GC-MS分析，共得到207種風(fēng)味物質(zhì)，其中不同處理方式下OAV＞100的關(guān)鍵呈香物質(zhì)主要以正己醛、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、壬醛、癸醛、BETA-環(huán)檸檬醛等五種醛類為主。GC-IMS共檢測出60種物質(zhì)，其中32種在庫中能檢索到對應(yīng)的化合物名稱?？傮w看來，在不同處理方式下青豆所含主要風(fēng)味物質(zhì)是固定的，如，正己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、正己醛、苯甲醛、甲基庚烯酮、反-2-辛烯醛、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪等在采用兩種分析時(shí)均被證明是不同處理方式下青豆的主要風(fēng)味物質(zhì)。但對于不同處理方式的特征風(fēng)味還是有對應(yīng)的變化。初步認(rèn)為，清洗、漂燙工藝與對照青豆的風(fēng)味差異不大。經(jīng)預(yù)冷、速凍等工藝的處理后，總體青豆香氣輪廓不變，醛、酯類物質(zhì)含量有所增加；在凍干、炒制處理后，醛類物質(zhì)有明顯的降低，且在炒制后吡嗪等雜環(huán)類化合物含量增加。根據(jù)本研究中不同處理方式下關(guān)鍵呈香物質(zhì)的差異，下一階段可結(jié)合相關(guān)加工產(chǎn)生特異性風(fēng)味的工藝進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)化研究，以尋找最佳的青豆加工方式。