黑小麥麩皮抗氧化活性成分提取及其抗氧化能力評(píng)價(jià)

于章龍 ，劉 瑞 ，宋 昱 ?，謝颯英 ，蔡 岳 ，孫元琳，郭園園，劉峰娟

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000；2. 運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000；3. 河津市通河食品有限公司，山西 運(yùn)城 044000）

麩皮是谷物加工的副產(chǎn)物，主要由皮層和糊粉層所組成。在實(shí)際制粉工藝中，提取胚和胚乳后的殘留物統(tǒng)歸為麩皮，約占籽粒重量的22%～25%左右[1]。麩皮中的維生素、礦物質(zhì)等較胚乳含量豐富，且富含多種生理活性物質(zhì)，其中酚類(lèi)物質(zhì)研究是熱點(diǎn)之一[2-3]。麩皮中主要酚類(lèi)物質(zhì)包括酚酸、黃酮、木酚素等。酚酸主要為阿魏酸，約占麩皮的 0.4%～0.7%，黃酮約占麩皮的0.2%[4-6]。大量研究證明，谷物中的酚類(lèi)化合物作為重要的膳食抗氧化組分，對(duì)預(yù)防人類(lèi)機(jī)體氧化應(yīng)激和心血管疾病具有突出的防護(hù)作用[7-8]。全谷物攝入對(duì)慢性疾病的預(yù)防作用主要?dú)w功于膳食纖維及其與之共價(jià)鍵連接的酚酸類(lèi)物質(zhì)，被稱為“膳食纖維-酚類(lèi)抗氧化劑復(fù)合物”[9]。而此類(lèi)活性物質(zhì)主要存在于谷物麩皮中。黑小麥?zhǔn)侵阜N子的顏色較深，呈藍(lán)、紫、紫黑、黑等顏色小麥的統(tǒng)稱，是目前研究機(jī)構(gòu)采取不同的育種手段而培育出來(lái)的特型優(yōu)質(zhì)小麥。黑小麥麩皮中不僅富含酚酸、黃酮且富含花青素[10-11]。本研究以黑小麥麩皮為原料提取抗氧化活性成分并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為黑小麥副產(chǎn)物的深加工及利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

運(yùn)黑14207麩皮：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所制??；1，1-二苯代苦味?；杂苫?、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸二銨鹽、福林試劑、沒(méi)食子酸，均為分析純：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV-9000S 可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限責(zé)任公司；2XZ-4B型真空冷凍干燥機(jī)：浙江臨海市永昊真空設(shè)備有限公司；KS-100AL超聲清洗機(jī)：深圳市潔康洗凈電器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JMFB70*30實(shí)驗(yàn)室小麥磨粉機(jī)：中儲(chǔ)糧公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 運(yùn)黑14207麩皮制備

按照GB/T20571—2006標(biāo)準(zhǔn)磨粉，并獲得試驗(yàn)材料麩皮。然后，將麩皮于-18 ℃下放置24 h，再經(jīng)真空冷凍干燥24 h后放入自封袋冷藏備用。

1.3.2 溶劑配制及萃取方法

分別配制50%、75%、100%甲醇、乙醇、丙酮溶液，以蒸餾水為對(duì)照。

準(zhǔn)確稱取麥麩20 g，按照料液比1∶10分別與上述溶液混合，40 kHz功率超聲輔助提取30 min，然后進(jìn)行抽濾，在0.09 Mpa、65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得提取液，再將提取液倒入平面玻璃器皿中，放置12 h后放入冰箱冷凍24 h，最后進(jìn)行冷凍干燥，稱重并計(jì)算得率。凍干樣品真空包裝冷藏備用。

1.3.3 提取物總酚含量測(cè)定

參照 Folin-Ciocalteu試劑法并稍作修改[12]。以沒(méi)食子酸（GAE）為標(biāo)準(zhǔn)品，總酚含量以每100 mg提取物（干基）中所含相當(dāng)于沒(méi)食子酸的質(zhì)量表示樣品中總酚含量（Total phenolic， TP）。

準(zhǔn)確移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)液、500 μL斐林試劑液和 6 mL蒸餾水于小試管中，1 400 r/min震蕩1 min，對(duì)照樣為純水。

加入2 mL15%Na2CO3溶液，繼續(xù)1 400 r/min震蕩0.5 min。然后用蒸餾水定容至10 mL。避光靜止2 h，然后在750 nm處測(cè)量吸光值。

總酚提取能力（Total phenolic extraction capacity， TPEC）=EY×TP×100。定義為溶液提取總酚能力。

1.3.4 提取物對(duì)DPPH自由基清除力測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[13-14]并稍作修改，清除力以半數(shù)抑制率IC50值計(jì)。

稱取樣品干物質(zhì) 0.2 g于錐形瓶，用 50 mL 75%乙醇溶解，密封超聲波輔助溶解，制備樣品濃度為4 mg/mL溶液。稱取0.2 g DPPH溶解于50 mL 75%乙醇，稀釋至濃度為0.04 mg/mL，避光保存。

將上述溶液各取5 mL等比例混合，避光靜置30 min后于517 nm處測(cè)定吸光值。樣品對(duì)DPPH清除率I%按照下式計(jì)算：

A-樣品和DPPH混合液的吸光度值

A1-陽(yáng)性空白（無(wú)DPPH溶液）吸光度值

A0-陰性空白（無(wú)樣品溶液）的吸光度值

將上述濃度為4 mg/mL樣品溶液分別配制成濃度為0.3、0.6、1.2、1.8、2.4、4 mg/mL的樣品液，然后與 DPPH溶液等比例混合，避光靜置30 min后測(cè)吸光度值。

抗氧化物提取能力（Antioxidants extraction capacity determined by DPPH， AEC）按照下式計(jì)算。

1.3.5 提取物對(duì)ABTS自由基清除力測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[15-16]并稍作修改，清除力以半數(shù)抑制率IC50值計(jì)。

稱取樣品干物質(zhì)0.2 g于錐形瓶中，用50 mL的蒸餾水溶解，超聲波輔助溶解，溶液澄清透明時(shí)停止，將樣品液稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL。

取1 mL樣品溶液與1.5 mL ABTS自由基溶液混合，靜置6 min，于420 nm處測(cè)定吸光值。清除率、IC50(ABTS)和AECABTS計(jì)算方法同1.3.4。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用origin 75作圖，利用SPSS V13.0軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用方差分析（ANOVA）和鄧肯檢驗(yàn)，半數(shù)抑制率IC50采用SPSS V13.0進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑麩皮提取物得率

麩皮中含有主要營(yíng)養(yǎng)成分為膳食纖維 35%～50%、淀粉 10%～15%、粗蛋白 12%～18%、脂肪3%～5%。由圖1可知，不同溶劑對(duì)麩皮提取物得率不同，75%乙醇溶劑得率最高，為10.72%，且與其他組差異顯著。純丙酮得率最低，為1.15%。而蒸餾水組提取物得率較高，可能是因?yàn)榈矸奂按值鞍兹芙廨^多。不同得率反應(yīng)了不同溶劑可提出的可溶性物質(zhì)含量不同。同時(shí)也可以看出，純甲醇、純乙醇溶劑提取得率相對(duì)較低。整體而言，不同濃度丙酮組提取率較低。

圖1 不同溶劑麩皮提取物得率Fig.1 Extraction rates of bran extracts in different solvents

2.2 不同溶劑麩皮提取物總酚含量及提取能力

一般而言，游離型和結(jié)合型酚類(lèi)物質(zhì)為可溶性酚類(lèi)，束縛型酚類(lèi)物質(zhì)則為不溶性酚類(lèi)，以酯鍵、糖苷鍵和醚苷鍵等形式與其他物質(zhì)相結(jié)合[17]。由圖 2可知 50%乙醇提取組總酚含量最多，為2.9 mgGAE/100 mg，但與對(duì)照蒸餾水組差異不顯著。100%丙酮提取組總酚含量最少，為1.14 mg/100 mg。由圖3可知，蒸餾水的總酚提取能力最強(qiáng)，且與其他各溶劑組差異顯著。50%、75%甲醇提取組和 50%、75%乙醇提取組總酚能力相對(duì)較強(qiáng)，且它們之間差異不顯著。100%丙酮提取組最弱。綜合圖2、圖3結(jié)果可知，50%乙醇更適于黑麥麩皮中總酚提取。

圖2 不同溶劑麩皮提取物總酚含量Fig.2 Total phenolic content of bran extracts with different solvents

圖3 不同溶劑麩皮提取物總酚提取能力Fig.3 Total phenolic extraction capacity of bran extracts with different solvents

2.3 DPPH 自由基清除率IC50值和AEC值

DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，被廣泛應(yīng)用于體外評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化性，尤其是酚類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定酚酸對(duì)DPPH自由基的清除能力可以評(píng)估其抗氧化性的強(qiáng)弱[18]。不同溶劑麩皮提取物對(duì) DPPH自由基清除率 IC50值見(jiàn)圖 4，IC50值越低，酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。由圖 4可知，50%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，但與75%乙醇和75%丙酮組差異不顯著。蒸餾水提取物對(duì)DPPH自由基清除能力最弱。

圖4 不同溶劑麩皮提取物對(duì)DPPH自由基清除率IC50值Fig.4 IC50 value of DPPH radical scavenging rate of bran extracts with different solvents

從圖 5可看出，50%和 75%乙醇提取物對(duì)DPPH的AEC值最高，且與其他組差異顯著。說(shuō)明其提取效果最好。

圖5 不同溶劑麩皮提取物對(duì)DPPH抗氧化物提取能力Fig.5 DPPH antioxidant capacity of bran extracts with different solvents

2.4 ABTS 自由基清除率IC50值和AEC值

由圖 6可知，75%丙酮 IC50值最小，為0.042 mg/mL，所以其提取物對(duì)ABTS自由基清除能力最強(qiáng)。而75%甲醇IC50值最大，為0.052 mg/mL，清除能力最弱。但總體而言，各組對(duì)ABTS自由基清除率IC50值之間差異并不是很顯著。

圖6 不同溶劑麩皮提取物對(duì)ABTS自由基清除率IC50值Fig.6 IC50 value of ABTS radical scavenging rate of bran extracts with different solvents

以ABTS計(jì)的抗氧化物提取能力，其值越高，提取效果越好，由圖7可以看出75%甲醇提取效果最好，且與其他組差異顯著。50%乙醇次之，75%丙酮提取效果最弱。

2.5 相關(guān)性分析

圖7 不同溶劑麩皮提取物對(duì)ABTS抗氧化物提取能力Fig.7 ABTS antioxidant capacity of bran extracts with different solvents

為了研究黑小麥麥麩提取物多酚含量及抗氧化性之間的關(guān)系，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表 1所示?？偡雍浚═P）與 TPEC和AECABTS呈極顯著正相關(guān)，與AECDPPH呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明 TP對(duì) AECABTS影響更大，黑小麥麩皮提取物的抗氧化性主要來(lái)源于多酚。TPEC和AECDPPH和AECABTS呈極顯著正相關(guān)，證明溶劑對(duì)總酚提取能力的水平與對(duì)DPPH和ABTS抗氧化物提取能力一致。

表1 相關(guān)性分析Table 1 Corr elation analysis

3 結(jié)論與討論

可食植物中天然存在的大部分多酚都是以游離或結(jié)合（與多糖或蛋白通過(guò)酯鍵和醚鍵）的形式存在[19-20]。在谷物中主要以結(jié)合態(tài)存在形式為主，且80%以上存在于谷物的麩皮和胚乳中[21-22]。游離型酚類(lèi)化合物通常可直接溶解在有機(jī)溶劑中，所以一般選用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等提取。由于細(xì)胞壁的影響，提取游離型酚類(lèi)化合物后的殘?jiān)腥杂写罅坎蝗艿姆宇?lèi)化合物，所以結(jié)合型酚類(lèi)化合物通常是指有機(jī)溶劑提取后的殘留物經(jīng)酸水解、堿水解或酶水解后提取得到的酚類(lèi)物質(zhì)。

本研究通過(guò)提取黑小麥麩皮抗氧化活性成分并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。50%乙醇提取總酚含量最高，為2.86 mg/100 mL；蒸餾水總酚提取能力最強(qiáng)，三種有機(jī)溶劑濃度為50%和75%時(shí)的提取能力都比純有機(jī)溶劑強(qiáng)，可知黑小麥麩皮多酚屬于中等極性物質(zhì)；50%乙醇 DPPH IC50值最小，對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，DPPH抗氧化物提取能力 75%乙醇提取效果最佳；75%丙酮ABTS IC50值最小，對(duì)ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，ABTS抗氧化物提取能力 75%甲醇提取效果最佳；黑小麥麩皮提取物總酚含量及總酚提取能力水平與對(duì)DPPH和ABTS抗氧化物提取能力一致。因此，不同溶劑提取物的抗氧化能力不同，綜合比較可知50%乙醇更適于黑小麥麩皮抗氧化活性成分提取。

所以，本研究酚類(lèi)物質(zhì)提取物主要為游離型酚類(lèi)化合物，且由于溶劑提取法提取的麩皮多酚粗提液中雜質(zhì)較多，會(huì)對(duì)其多酚含量及其活性評(píng)價(jià)造成干擾，因此有必要對(duì)其多酚粗提液進(jìn)行純化，去除蛋白質(zhì)和糖分等雜質(zhì)，再結(jié)合其它輔助方法來(lái)提高得率，從而得到純度更高的多酚類(lèi)物質(zhì)，科學(xué)地評(píng)價(jià)黑麥麩皮多酚的生物活性。