龜鮑曼不動(dòng)桿菌和摩氏摩根菌雙重PCR診斷方法建立

方振華，蒙美姑，黨朝暉，洪美玲，丁 利

(1.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 熱帶農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南 ?？?570216； 2.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571158 )

甲、頭肢部潰爛、蛻皮等[4,7,9]，給龜鱉養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。感染摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌后，龜?shù)呐R床癥狀及剖檢病理變化較為相似，如腹甲、皮膚等潰爛，內(nèi)臟出血等，發(fā)病迅速，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致龜鱉的大量死亡，有時(shí)兩種致病菌呈交叉感染。但兩種菌在臨床治療上有一定的差異，如龜源鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)慶大霉素耐藥，而摩氏摩根菌對(duì)慶大霉素敏感等。故兩種菌的鑒別診斷對(duì)于臨床治療尤為重要。目前針對(duì)疾病的診斷依然采用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，但因其方法繁瑣、工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)、敏感度低，遠(yuǎn)不能滿足龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)上的迫切需求。龜鱉疾病傳統(tǒng)的診斷方法很難同時(shí)快速檢測(cè)兩種病原菌，臨床鑒別診斷困難。因此研究靈敏度高、特異性強(qiáng)的PCR快速檢測(cè)方法尤為迫切和必要。通過對(duì)龜鱉摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌及兩種病原菌混合感染的快速鑒別診斷，可迅速明確病原菌，有針對(duì)性地指導(dǎo)用藥，可為龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)中該類疾病的預(yù)防和治療提供參考和幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

龜源鮑曼不動(dòng)桿菌、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)及惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)均為實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑

ExTaq酶(5 U/μL)購(gòu)自Promega公司；組織基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司、DL2000 DNA Marker、dNTP等常規(guī)PCR試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gryB基因引物序列見表1，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物的核苷酸序列、擴(kuò)增長(zhǎng)度及登錄號(hào)

1.4 DNA模板的制備

將凍存的鮑曼不動(dòng)桿菌和摩氏摩根菌接種于LB 液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后將菌液離心，收集細(xì)菌沉淀，按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌DNA。

1.5 單重及雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

應(yīng)用鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gryB基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并進(jìn)行序列測(cè)定。然后對(duì)雙重PCR反應(yīng)的退火溫度、引物濃度、MgCl2濃度、dNTP濃度等進(jìn)行優(yōu)化。按25 μL反應(yīng)體系：引物(10 μmol/L)分別為0.5 μL(0.2 μmol/L)、0.75 μL(0.3 μmol/L)、1 μL(0.4 μmol/L)和1.25 μL(0.5 μmol/L)，退火溫度分別為55.0、55.5、56.4、57.7、59.3、60.6、61.5、62.0 ℃，dNTP(2.5 mmol/L)分別為0.5 μL(0.125 mmol/L)、1.0 μL(0.25 mmol/L)、2.0 μL(0.5 mmol/L)和3.0 μL(0.75 mmol/L)，MgCl2(25 mmol/L)分別為0.5 μL(1.25 mmol/L)、1.0 μL(2.5 mmol/L)、2.0 μL(5 mmol/L)和3.0 μL(7.5 mmol/L)進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，每?jī)?yōu)化一項(xiàng)時(shí)保持其他條件不變。

1.6 雙重PCR方法特異性試驗(yàn)

分別用龜源鮑曼不動(dòng)桿菌、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯氏菌、維氏氣單胞菌及惡臭假單胞菌DNA 作為模板，按1.5中優(yōu)化好的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)該雙重PCR方法的特異性進(jìn)行分析。

1.7 雙重PCR方法敏感性試驗(yàn)

提取鮑曼不動(dòng)桿菌、摩氏摩根菌DNA，經(jīng)超微量核酸分光光度計(jì)測(cè)定濃度。將2種菌的DNA等量混合，然后做10倍倍比稀釋，以不同稀釋倍數(shù)的DNA混合物為模板(2.0 μL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得所建立的雙重PCR方法的敏感性。

1.8 雙重PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

采集海南省多家龜鱉養(yǎng)殖場(chǎng)病死龜肝臟等組織樣本，參照試劑盒說(shuō)明書中的操作步驟進(jìn)行病料組織DNA的提取，以此為模板進(jìn)行單重和雙重PCR檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 單重PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用設(shè)計(jì)好的鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB基因特異性引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，分別獲得約401、917 bp大小的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。經(jīng)序列比對(duì)分析顯示，獲得的PCR產(chǎn)物與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因及摩氏摩根菌gryB基因序列的同源性均在99%以上。

2.2 雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

通過對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB基因的引物濃度、退火溫度、dNTP濃度、MgCl2濃度進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，上、下游引物各為0.3 μmol/L時(shí)具有較好的擴(kuò)增效果(圖2a)；退火溫度為55～59.3 ℃均能擴(kuò)增出較清晰的條帶，根據(jù)特異性原則，確定退火溫度為59.3 ℃(圖2b)；dNTP濃度為0.5 mmol/L；MgCl2濃度為5 mmol/L(圖3)。

2.3 特異性試驗(yàn)

由特異性試驗(yàn)結(jié)果可知，鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB出現(xiàn)2條清晰條帶，大小分別約為401、917 bp，而龜源肺炎克雷伯氏菌、維氏氣單胞菌及惡臭假單胞菌均未擴(kuò)增出目的片段(圖4a)。

2.4 敏感性試驗(yàn)

分別對(duì)摩氏摩根菌DNA(125.7 ng/μL)和鮑曼不動(dòng)桿菌的DNA(41.2 ng/μL)進(jìn)行10倍倍比稀釋作為擴(kuò)增模板，其中摩氏摩根菌DNA質(zhì)量濃度依次為125.7、12.57、1.257、1.257×10-1、1.257×10-2、1.257×10-3、1.257×10-4ng/μL，鮑曼不動(dòng)桿菌的DNA質(zhì)量濃度依次為41.2、4.12、4.12×10-1、4.12×10-2、4.12×10-3、4.12×10-4、4.12×10-5ng/μL。模板等體積混合物(各1 μL)PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明，雙重PCR方法對(duì)摩氏摩根菌最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為1.257×10-3ng/μL，鮑曼不動(dòng)桿菌最低檢測(cè)核酸質(zhì)量質(zhì)量濃度為4.12×10-3ng/μL(圖4b)。

2.5 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

對(duì)臨床32例疑似病料應(yīng)用雙重PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌感染12例，摩氏摩根菌11例(圖5)，陽(yáng)性檢出率分別為37.5%和34.4%，混合感染5例，陽(yáng)性檢出率為15.6%(表2)，與單一PCR的陽(yáng)性檢出率一致。

圖1 單重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of single PCR M.DL2000DNA marker; 1.鮑曼不動(dòng)桿菌rpoB基因; 2.摩氏摩根菌gyrB基因. M.DL2000DNA marker; 1.rpoB gene of A. baumannii; 2. gyrB gene of M. morganii.

圖3 雙重PCR dNTP(a)和MgCl2濃度(b)優(yōu)化結(jié)果Fig.3 The optimization of dNTP (a) and MgCl2 concentration (b) of duplex PCR a: M.DL2000 marker; 1.0.125 mmol/L; 2.0.25 mmol/L; 3.0.5 mmol/L; 4.0.75 mmol/L. b: M.DL2000 marker; 1.7.5 mmol/L; 2.5 mmol/L; 3.2.5 mmol/L; 4.1.25 mmol/L.

圖4 雙重PCR的特異性(a)和敏感性(b)檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The test results of specificity (a) and sensitivity (b) of duplex PCR a: M.DL2000 DNA marker; 1.鮑曼不動(dòng)桿菌; 2.摩氏摩根菌; 3.鮑曼不動(dòng)桿菌和摩氏摩根菌; 4.肺炎克雷伯氏菌; 5.維氏氣單胞菌; 6.惡臭假單胞菌.b: M.DL2000Marker; 1～7.模板DNA依次稀釋100～106倍. a: M.DL2000 DNA marker; 1.A. baumannii; 2.M. morganii; 3.A. baumannii and M. morganii; 4.K. pneumoniae; 5.A. veronii; 6.P. putida.b: M.DL2000Marker; 1—7.template DNA diluted by 100～106 times.

圖5 臨床樣本雙重PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The test results of clinical samples by duplex PCR M.DL2000 marker; 1～32.臨床樣本. M.DL2000 marker; 1—32.clinical samples.

表2 臨床樣品單重和雙重PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

龜鱉養(yǎng)殖因所需飼料、用量、人工、用地面積均較少，養(yǎng)殖回報(bào)率高，并且龜鱉具有較高的食用、藥用和觀賞價(jià)值等，已成為特種水產(chǎn)養(yǎng)殖的熱點(diǎn)和經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。在21世紀(jì)初發(fā)展迅猛，多種養(yǎng)殖模式在各省尤其是廣東、廣西、福建和海南得到迅速發(fā)展，形成了面積規(guī)?；⒎N類多樣化、數(shù)量集約化的產(chǎn)業(yè)化模式[1-2,18]。龜鱉養(yǎng)殖蓬勃發(fā)展、貢獻(xiàn)日益凸顯的同時(shí)，也受到疾病的嚴(yán)重困擾和威脅。如鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯氏菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、摩氏摩根菌等感染龜鱉后，可引起龜鱉發(fā)病，嚴(yán)重者可造成其大量死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失[4,7,19]。

3.1 摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌在龜鱉養(yǎng)殖業(yè)中的發(fā)病情況

摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌均屬于條件致病菌，在水體、土壤及空氣中廣泛分布，可引起嚴(yán)重的感染，導(dǎo)致包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物死亡[14,20]。同時(shí)摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌也是嚴(yán)重危害我國(guó)龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病病原。如摩氏摩根菌感染黃喉擬水龜(Mauremysmutica)可致其死亡[9-10]，摩氏摩根菌可導(dǎo)致中華鱉(Trionyxsinensis)感染頭面部癤瘡及出血性腸道壞死疾病[7-8]；鮑曼不動(dòng)桿菌感染龜主要引起背腹甲糜爛、潰瘍，內(nèi)臟出血等病癥[4]，感染中華鱉引起穿孔病、腐皮病、溶血性腹水病等癥狀[21]。由目前的多例病理報(bào)道不難發(fā)現(xiàn)，龜鱉感染摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌后，臨床癥狀及病理變化較為接近，而且本課題組在多年的研究中也發(fā)現(xiàn)，這兩種菌感染率和發(fā)病率均較高，并時(shí)常呈現(xiàn)交叉感染，給臨床鑒別診斷和防治造成了嚴(yán)重的困難。尤其是目前龜鱉細(xì)菌性疾病多依賴抗生素進(jìn)行防治，而抗生素的頻繁使用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使疾病的診治愈來(lái)愈困難和復(fù)雜[5]。同時(shí)龜鱉疾病的研究起步相對(duì)較晚，研究基礎(chǔ)較為薄弱，針對(duì)病原菌的診斷，多是采用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如病原菌分離、形態(tài)學(xué)觀察、理化鑒定等。此類方法工作量大、繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，遠(yuǎn)不能滿足龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)的迫切需求，雖然目前也有針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌和摩氏摩根菌的分子生物學(xué)診斷方法[4,10]，但多是針對(duì)單一病原菌的PCR檢測(cè)。因此研究靈敏度高、特異性強(qiáng)的龜鱉病原菌快速診斷技術(shù)和方法尤為迫切和必要。

3.2 龜源摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌診斷方法的建立

gyrB基因和rpoB基因常分別被應(yīng)用于摩氏摩根菌和不動(dòng)桿菌屬菌種分類及鑒定[22-23]。故筆者選用此兩種基因設(shè)計(jì)引物，均獲得特異性目的條帶，通過對(duì)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了快速鑒別診斷摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌及其混合感染的雙重PCR診斷方法。此外，為檢驗(yàn)該雙重PCR方法的特異性，本試驗(yàn)選用了龜鱉養(yǎng)殖中常見的一些病原菌如龜源維氏氣單胞菌、惡臭假單胞菌及肺炎克雷伯氏菌。雖然已有報(bào)道嗜水氣單胞菌可引起龜鱉發(fā)病，但近幾年并未在龜鱉養(yǎng)殖場(chǎng)篩查出該菌，故檢驗(yàn)雙重PCR方法特異性試驗(yàn)時(shí)未選用嗜水氣單胞菌。由特異性結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)上述致病菌均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明該方法的特異性較高。此外，本方法的檢出率與單一PCR方法無(wú)差異。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)所建立的針對(duì)兩種病原菌檢測(cè)的雙重 PCR方法具有較強(qiáng)的特異性，僅對(duì)摩氏摩根菌和鮑曼不動(dòng)桿菌有擴(kuò)增，對(duì)其他病原菌如肺炎克雷伯氏菌、維氏氣單胞菌及惡臭假單胞菌等無(wú)擴(kuò)增；此方法靈敏度高，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌和摩氏摩根菌最低檢測(cè)質(zhì)量濃度分別為4.12×10-3ng/μL和 1.257×10-3ng/μL，在臨床病料的檢測(cè)上與單一PCR檢測(cè)結(jié)果一致。該方法可為龜鱉類鮑曼不動(dòng)桿菌和摩氏摩根菌的鑒別診斷和臨床調(diào)查提供幫助。