基于位點特異性打分矩陣的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡預測SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

鐘 琦，黃志鑫 ，陳曉舟

(1.云南民族大學 數(shù)學與計算機科學學院, 云南昆明 650500;2.常州大學 華羅庚學院, 江蘇 常州 213100)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2 )屬于β屬的新型冠狀病毒,它具有包膜,顆粒呈圓形,或者是橢圓形,并且為多形型.由新型冠狀病毒引起的新型冠狀病毒肺炎于2020 年2 月11 日被世界衛(wèi)生組織正式命名為:2019 冠狀病毒病(COVID-19, 即corona virus disease 2019).COVID-19 傳播速度極快, 傳播能力極強, 到目前為止, 已經(jīng)導致了全世界多個地區(qū)數(shù)百萬的確診病例以及數(shù)十萬的死亡人數(shù), 對全世界人民的健康都構(gòu)成了巨大威脅. 核衣殼蛋白(nuclocapsid protein) 即N 蛋白, 通過N 基因來參與編碼的過程, 是冠狀的病原體刺激內(nèi)體從而產(chǎn)生抗體的蛋白, 這種蛋白對于醫(yī)學的各個領(lǐng)域均具有診斷的價值. 它與病毒基因組RNA 相互纏結(jié)形成病毒核衣殼, 非常關(guān)鍵地對病毒核糖核苷酸的形成過程起了作用. 且N 蛋白相對比較保守, 所在SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)蛋白中占到最大比例, 且研究抗原檢測發(fā)現(xiàn)，患上SARS后，從初期病狀發(fā)生即可在患者血清中檢測到核衣殼蛋白，而SARS的全基因組序列又與SARS-CoV-2的高度同源.因此, 研究分析SARS-CoV-2 N 蛋白的結(jié)構(gòu)有很重要的意義.

美國國家生物信息中心(national center for biotechnology information, NCBI), NCBI 的網(wǎng)址為:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.NCBI 主要包括了很多與生物醫(yī)學與技術(shù)有關(guān)的開源數(shù)據(jù)庫, 其首頁展示了諸如化學和生物分析(chemicals & bioassays), 數(shù)據(jù)和軟件(data & software), 基因表達(genes & expression), 蛋白質(zhì)(proteins) 以及分類學(taxonomy) 等資源, 而我們所需要的SARS-CoV-2 核衣殼蛋白序列就是源于NCBI 數(shù)據(jù)庫.

在研究SARS-CoV-2 N 蛋白二級結(jié)構(gòu)方面,秦照玲等[1]對成功表達、純化出SARS-CoV-2 N重組蛋白的研究,為提出SARS-CoV-2的快速診斷方法以及開展SARS-CoV-2 N蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ). 秦小波等[2]應用ExPASy 服務器上的SOPMA、GOR 兩個在線工具預測N 蛋白的二級結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)這兩種工具對SARS-CoV-2 N 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測有較好的一致性, 以無規(guī)卷曲為主. 并且這篇文章也是2020 年6 月17 日《生物學雜志》網(wǎng)絡首發(fā)的對新冠病毒N 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測的論文. 由于本文主要也針對新冠病毒N蛋白二級結(jié)構(gòu)做預測, 但是差異在于我們是采用深度學習的方法來做N 蛋白的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測, 具有創(chuàng)新性, 結(jié)果準確并取得了較高的蛋白質(zhì)8類二級結(jié)構(gòu)的準確度為70%.在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測研究方面,王蕾蕾等[3]提出了1種新的算法模型卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(Convolution neural network 即CNN), 分類層采用Softmax, 這個算法模型即CNN-Softmax 對CNN 的層次架構(gòu)進行了改進, 每層卷積后都加入了ReLU 激活層以便優(yōu)化梯度消失的問題, 通過提取特征后輸入Softmax 分類器, 在25PDB 數(shù)據(jù)集上提高了3類二級結(jié)構(gòu)的正確率, 準確率為78.38%. 針對同樣采用CNN的算法模型，我們的模型與之不同在于我們采用了3層的全連接層，通過第1、2層的RELU函數(shù)進行通道降維在連接第3層的Softmax函數(shù)進行8類二級結(jié)構(gòu)的預測，我們的方法速度快，最后生成一個分類向量，結(jié)果清晰可見，一目了然，能對N蛋白的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)做出準確預測.謝尚欣等[4]提出了1種用CNN對蛋白質(zhì)序列進行特征提取,然后使用模糊支持向量分類機(fuzzy support vector classifiers)來分類的名為CNN-FSVM 的算法,3類二級結(jié)構(gòu)的準確率也達到了83.6%.張帥燕等[5]提出一種新的基團編碼方式將基團編碼與位點特異性打分矩陣(Position-specific scoring matrix 即PSSM)的組合矩陣提取蛋白質(zhì)序列特征后再送入貝葉斯分類器中進行分類預測, 獲得了73.19% 的3類二級結(jié)構(gòu)準確率.運用深度學習的方法來對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測的例子很多，但本研究卻做出了既在使用深度學習方法的同時又能對研究某種單一蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)做出準確預測，這為后者利用深度學習預測某種單一蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)提出了可能，也有利于新型冠狀病毒的診斷.

1 利用MAFFT 對SARS-CoV-2 N 蛋白與SARS-CoV N 蛋白做序列比對分析

1.1 數(shù)據(jù)來源

從NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取SARS-CoV-2 N 蛋白與SARS-CoV N 蛋白的氨基酸序列, SARS-CoV-2 N 蛋白序列編號為(QHO62115.1), SARS-CoV N 蛋白序列編號為(AAP41047.1).

1.2 序列比對分析

在文獻[6]中介紹MAFFT 工具(www. ebi. ac. uk/ Tools/ msa/ mafft) 是1種非?？焖俚亩嘈蛄斜葘ぞ? 這種工具是基于快速傅里葉變換的方法進行多重對比, 其顯著特點是速度快, 尤其對于高度保守的序列更為明顯. 我們使用該工具對SARS-CoV-2 N 蛋白與SARS-CoV N蛋白的氨基酸序列做了比對, 得到結(jié)果如表1所示:

對表1進行結(jié)果分析: 源于NCBI 數(shù)據(jù)庫可知, SARS-CoV-2 N 的序列長度為419 個氨基酸殘基, SARS-CoV N 的序列長度為422 個氨基酸殘基. 由表1 可以發(fā)現(xiàn), 2條序列以位點一致為主, 氨基酸序列比對結(jié)果顯示相似性高達90.5%, 具有高度同源.此結(jié)果提示我們, SARS-CoV N 蛋白的研究成果可用作COVID-19 的疾病診斷和疫苗開發(fā)的參考依據(jù).

2 利用在線工具預測SARS-CoV N 蛋白的理化性質(zhì)與疏水性

2.1 利用在線工具軟件ProtParam 預測SARS-CoV-2 N 蛋白理化性質(zhì)

我們通過ExPASy 的ProtParam 在線工具(https://web.expasy.org/protparam/) 預測得到, SARS-CoV-2 N 蛋白由419 個氨基酸殘基組成, 氨基酸組成成分如表2 所示.

通過ProtParam 分析表明, 天冬氨酸和谷氨酸是附負電荷的氨基酸殘基, 總數(shù)是36 個, 附正電荷的氨基酸殘基總數(shù)是60 個, 等電點的理論值為10.07, 從蛋白質(zhì)的酸堿性看它屬于堿性; 測定了N 蛋白的原子結(jié)構(gòu)顯示, 共由 6 351 個原子組成, 相對分子質(zhì)量為:45 625.70, 化學分子式為C1971H3137N607O629S7. 不穩(wěn)定系數(shù)為55.09, 40 為此系數(shù)的臨界值, 55.09>40 表明SARS-CoV-2 N 蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白. 測定結(jié)果表明SARS-CoV-2 N 蛋白氨基端可能為甲硫氨酸(Met).

表2 SARS-CoV-2 N蛋白氨基酸組成信息

2.2 利用在線工具軟件ProtScale 預測新型冠狀病毒核衣殼蛋白疏水性

我們利用ExPASy 的ProtScale 在線工具(https://web.expasy.org/protscale/) 預測得到SARS-CoV-2 N 蛋白的疏水性, 由ProtParam 分析結(jié)果表明可知, 文獻[7]介紹脂肪族氨基酸指數(shù)(Aliphatic index 即AI)指蛋白質(zhì)中脂肪側(cè)鏈的相對占有量, 介紹總平均親水性(Grand average of hydrapathicity 即GRAVY) 為蛋白質(zhì)中全部殘基親水性總值與氨基酸數(shù)量之比. 而我們的預測結(jié)果得到SARS-CoV-2 N 蛋白AI 值為52.53, GRAVY 值為-0.971, 其閾值為[-2, 2],可見SARS-CoV-2 N 蛋白的GRAVY 值為負數(shù), 反之為正數(shù)就是疏水性, 說明SARS-CoV-2 N 蛋白具有強親水性. 疏水性結(jié)果圖如圖1 所示:

分析圖1 結(jié)果: 橫軸的Position 代表氨基酸殘基的位置, 縱軸的Score 代表疏水性分值.

3 利用深度學習的算法預測新型冠狀病毒核衣殼蛋白二級結(jié)構(gòu)

3.1 數(shù)據(jù)預處理

采用PSSM 提取SARS-CoV-2 N 蛋白序列特征.位點特異性打分矩陣(position-specific scoring matrix 即PSSM)是采用特殊位置重復基本局部對齊搜索工具即PSI-BLAST 在Swiss-Prot 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中進行比對, 將SARS-CoV-2 N 蛋白即目標蛋白與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)鏈進行多序列比較, 通過輸入命令: psiblast-query a.fasta-db./ db/ swissprot- num_ iterations3- out_ ascii-pssm 1.pssm. 即可將我們需要預測的蛋白質(zhì)生成20維的PSSM譜編碼.經(jīng)過PSI-BLAST 3次迭代完成后, 我們選取前20列所需要的打分矩陣, 由于生成的是整數(shù)矩陣, 進一步選用Sigmoid 函數(shù)將PSSM 譜編碼中的整數(shù)重新調(diào)整即映射到[0,1]區(qū)間.Sigmoid 函數(shù)歸一化處理公式如下:

f[x]=1/1+exp(x).

滑動窗口技術(shù)是在預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中用于對蛋白質(zhì)序列的采樣, 本實驗基于滑動窗口技術(shù)對中心蛋白質(zhì)的預測方式來預測蛋白質(zhì)的8類二級結(jié)構(gòu),此操作的實現(xiàn)需要預先訓練CNN, 選用窗口大小為17(窗口選擇應為奇數(shù),且17的窗口大小也是我們實驗的最佳選擇)的窗口, 從左向右依次取窗口大小的片段, 當相鄰的殘基片段不足匹配我們選取的窗口大小時均采用零向量來填充. 以我們數(shù)據(jù)預處理的第1次滑動就可以得到1個340(20×17) 維的氨基酸序列, 并用20×17 的一維向量對氨基酸進行了表征.

3.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)介紹

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定了其功能. 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)[6]是指多肽鏈主鏈原子借利用氫鍵沿一維方向排列產(chǎn)生的1種周期性結(jié)構(gòu)狀態(tài), 是多肽鏈局部的空間構(gòu)象. 一般來說, 包括β折疊,β轉(zhuǎn)角, 無規(guī)卷曲等形式. 實驗進行8類二級結(jié)構(gòu)預測,8類二級結(jié)構(gòu)如表3 所示:

表3 8類蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

3.3 數(shù)據(jù)集選取

實驗中使用了通用的基準數(shù)據(jù)集CB513. 該數(shù)據(jù)集包含513 個不重復的蛋白質(zhì)序列, 它們的相似度在1/4以下. 通過觀察數(shù)據(jù)集, 我們發(fā)現(xiàn)其中許多是NoSeq 結(jié)構(gòu), 指的是CB513 數(shù)據(jù)集中把每一個蛋白質(zhì)鏈都補成了700 的長度的氨基酸, 但是這種NoSeq 結(jié)構(gòu)對實際的預測準確率會有很大的影響, 是毫無意義的. 所以實驗將數(shù)據(jù)集中的NoSeq 結(jié)構(gòu)消去, PSSM 譜用來代替20 種氨基酸殘基. 由于CB513 數(shù)據(jù)集里有57 個通道, 我們調(diào)用函數(shù)目的是選用28 個特征用來訓練我們的模型, 前20 個代表氨基酸殘基, 后8 個代表蛋白質(zhì)8類二級結(jié)構(gòu). 我們隨機打亂數(shù)據(jù)集后把數(shù)據(jù)集分成80% 的數(shù)據(jù)用來訓練模型, 剩下的數(shù)據(jù)采用1∶1 的比例分別對模型進行測試與驗證. 而文中的目標蛋白即SARS-CoV-2 N 蛋白序列可以從NCBI 上進行fasta 文件下載, 這樣我們的SARS-CoV-2 N 蛋白數(shù)據(jù)可以重塑為1 種蛋白質(zhì)×419 個氨基酸殘基×28 種特征.

3.4 算法設計

文中設計的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡是由輸入層, 隱含層包括3個一維卷積層和3個一維輸入的最大池化層, 與3個全連接層構(gòu)成. 卷積層使用卷積核對數(shù)據(jù)提取特征與特征映射, 而池化層會對經(jīng)過卷積層形成的特征圖進行特征提取與信息過濾. 我們數(shù)據(jù)輸入類型是(蛋白質(zhì)個數(shù)×氨基酸數(shù)目)×滑動窗口數(shù)17×氨基酸殘基種類20. 在第1層卷積中設置了128 個卷積核, 卷積窗口的長度為5, 步長為1. 每經(jīng)過卷積后都設置了relu 激活函數(shù), 函數(shù)表現(xiàn)形式如下:

f(x)=max(0,x).

使用這種激活函數(shù)的好處是不會出現(xiàn)梯度消失的問題. 加入了批標準化(Batch Normalization, BN)層, 使得收斂速度和準確率得以提升. 選取的最大池化層為2×2, 步長為2. 還建立了平坦(Flatten) 層, 由于經(jīng)過卷積核的卷積, 導致數(shù)據(jù)的維度發(fā)生了變化, 但是加入了平坦層后能將待處理的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成一維的向量, 對應到輸入層的神經(jīng)單元上. 全連接層第1、2層均采用relu 激活函數(shù), 最后1層使用Softmax 函數(shù). Softmax 函數(shù)用在超過兩類的分類情況中, 它把輸出的整數(shù)值經(jīng)過函數(shù)公式重新調(diào)整到(0, 1)區(qū)間里, 有如下的函數(shù)表達式:

因此, 我們的算法模型圖走向流程如圖2 所示.圖中，Con-1, 2, 3表示一維卷積層1, 2, 3; dro-1, 2, 3代表dropout層, 它的作用是消除過擬合;den1-3表示第1, 2, 3全連接層.

圖2 算法模型圖

3.5 仿真結(jié)果與分析

3.5.1 仿真結(jié)果

本實驗將經(jīng)過PSSM 譜編碼后的SARS-CoV-2 N 蛋白序列輸入CNN 模型后進行預測, 把數(shù)據(jù)輸入模型得出結(jié)果的流程圖如圖3 所示.

圖3 SARS-CoV-2 N蛋白二級結(jié)構(gòu)預測流程圖

圖4 是我們通過仿真得到的模型準確率圖.

圖4 CNN準確率

由圖4 可得, train表示訓練集，validation表示驗證集.本實驗設置40次迭代次數(shù), 得到模型測試集的準確度Q8 達到70%, Q8 代表蛋白質(zhì)8類二級結(jié)構(gòu)的預測準確度, Q8 的表達如下:

公式中的N表示氨基酸殘基總長度,Sii表示預測得到的第i類中確實第i類的氨基酸數(shù)目. 預測結(jié)果為從窗口采集的樣品中心殘基的二級結(jié)構(gòu), 再把每列的數(shù)據(jù)加以匯總, 預測得到的結(jié)果如表4 所示:

表4 SARS-CoV-2 N蛋白8類二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

由結(jié)果表4 可以看出, SARS-CoV-2 N 蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主.

3.5.2 仿真分析

本實驗提出用深度學習算法來對SARS-CoV-2 N 蛋白的8類二級結(jié)構(gòu)進行預測,并取得了與文獻[1]中秦小波等人使用ExPASy 服務器上的SOPMA、GOR 2個在線工具預測得到的結(jié)果一致, 說明SARS-CoV-2 N 蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲占多.

文獻[2]中2種常用的在線預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)方法與我們的實驗方法的對比結(jié)果如表5所示:

表5 SARS-CoV-2 N蛋白3種二級結(jié)構(gòu)預測方法對比結(jié)果

由對比結(jié)果表5表示，我們應用的深度學習的方法比現(xiàn)有常用的兩項快速預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)方法的準確度高，且我們的實驗結(jié)果均顯示SARS-CoV-2 N蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲占主，實驗結(jié)果準確有效.

用深度學習模型來對SARS-CoV-2 N 蛋白的8類二級結(jié)構(gòu)進行預測, 并成功取得了有效的結(jié)果. 但實驗也存在不足之處, 其一, 就利用PSSM 提取特征的數(shù)據(jù)庫選取這一塊, 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫有很多, 文中選擇在Swiss-Prot 中進行比對, 但是此數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)數(shù)量偏少, 所以可以考慮使用更大的數(shù)據(jù)庫進行多重序列比對從而獲得更好的位點特異性打分矩陣; 其二, 可以參考蛋白質(zhì)的進化信息對PSSM 進行相應添加, 比如可以添加疏水因子進去, 得到的預測效果可能會更好.

4 結(jié)語

本實驗分析SARS-CoV-2 核衣殼蛋白與SARS-CoV 核衣殼蛋白的序列相似性, 對SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的理化性質(zhì)和疏水性進行分析; 在此基礎(chǔ)上提出基于位點特異性打分矩陣的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡, 預測SARS-CoV-2 核衣殼蛋白的八類蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu). 研究結(jié)果表明, 核衣殼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)卷曲. 這為接下來使用深度學習模型對某種未知蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預測提供了參考. 總而言之, 本實驗為后續(xù)使用深度學習模型對某種未知蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預測的實驗提供了可能, 得知SARS-CoV-2 N 蛋白的一級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)信息, 從而為新型冠狀病毒肺炎的診斷以及疫苗的培育提供了參考.