基于線粒體基因的云南省煙田煙蚜繭蜂的種群遺傳多樣性研究

馮增貝，張翠萍，李紅娟，杜振勇，李 虎，周文兵

(1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院昆蟲學(xué)系，北京 100193；2 云南煙草公司，玉溪市分公司，玉溪 653100)

蚜蟲是一類重要的農(nóng)業(yè)害蟲，其繁殖率高、生命周期短、防治難度大.長(zhǎng)期以來使用化學(xué)農(nóng)藥防治，使蚜蟲對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥產(chǎn)生了一定的抗藥性[1].此外，過度使用化學(xué)農(nóng)藥還帶來許多不利后果，如農(nóng)藥殘留和農(nóng)業(yè)面源污染等，嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，威脅人類健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[2].生物防治技術(shù)利用了生物物種間的相互關(guān)系，可以通過一次性或多次引入天敵來抑制害蟲，達(dá)到良好的防治效果，大大降低化學(xué)農(nóng)藥的使用[3-4].煙蚜(Myzuspersicae)亦稱桃蚜，是煙草上的常發(fā)性害蟲和重點(diǎn)防控對(duì)象，寄主包括30科400多種植物[5-8]，能夠傳播100多種病毒[9-10],煙蚜是在煙草整個(gè)生長(zhǎng)期均有發(fā)生，通過刺吸取食煙葉，傳播煙草病原物，造成煙葉的質(zhì)量和產(chǎn)量下降.

煙蚜繭蜂(Aphidiusgifuensisashmaed)是煙蚜優(yōu)勢(shì)內(nèi)寄生蜂[5,12-15]，自然寄生率達(dá)30%～60%[14]，對(duì)煙蚜有較強(qiáng)的控制作用[15].具有產(chǎn)卵量大、壽命長(zhǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，能長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)控制蚜蟲危害，在煙蚜的生物防治中具有十分廣闊的應(yīng)用前景[8].

我國(guó)針對(duì)煙蚜繭蜂的研究開始于20世紀(jì)80年代，主要集中在其生物學(xué)、生態(tài)學(xué)及生物防治利用等方面.趙萬源等[5]曾在云南玉溪煙田對(duì)煙蚜繭蜂開展生物學(xué)及應(yīng)用的初步研究，結(jié)果表明利用煙蚜繭蜂防治煙蚜的想法是有可能實(shí)現(xiàn)的.隨后，湯玉清等[16]、忻亦芬[17]、畢章寶等[18-19]分別在煙蚜繭蜂的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)等方面開展了相關(guān)研究.2007年，云南煙區(qū)開始規(guī)?；瘮U(kuò)繁和釋放煙蚜繭蜂進(jìn)行煙蚜的田間防治，并取得了良好的應(yīng)用效果；經(jīng)過十多年的研究和應(yīng)用，云南省主要煙區(qū)煙蚜繭蜂繁育和釋放的設(shè)施與技術(shù)均相對(duì)成熟.近幾年，該技術(shù)逐漸開始在在全國(guó)范圍內(nèi)推廣應(yīng)用[20]，目前云南、貴州、廣西、吉林、山東、湖南等國(guó)內(nèi)主要煙區(qū)都實(shí)現(xiàn)了煙蚜繭蜂的大規(guī)模擴(kuò)繁和產(chǎn)品的開發(fā)，并投入到實(shí)際生產(chǎn)中[20-25].雖然煙蚜繭蜂具有廣闊的應(yīng)用前景和良好的防治效果，但是在其工廠化擴(kuò)繁和人工釋放等過程中仍存在許多問題，尤其是蜂群的退化問題[26].工廠化擴(kuò)繁的煙蚜繭蜂存在長(zhǎng)期近親繁殖、不當(dāng)引種、飼養(yǎng)環(huán)境不良等因素的影響[27]，造成蜂群遺傳多樣性下降和種群的衰退，釋放到田間后適應(yīng)環(huán)境的能力下降，表現(xiàn)出生殖力衰退、寄生效果下降、整體種群競(jìng)爭(zhēng)力減弱等問題而難以定殖.

目前，關(guān)于云南省主要煙田煙蚜繭蜂種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，以及長(zhǎng)期的大規(guī)模人工擴(kuò)繁和田間釋放是否對(duì)其種群遺傳多樣性產(chǎn)生了影響等問題尚不明確，相關(guān)研究缺乏.本研究利用atp6、cox1、cob和nad2 4個(gè)線粒體基因的全序列作為分子標(biāo)記，對(duì)云南省11州市19個(gè)樣點(diǎn)的煙田和工廠繁育種群以及1個(gè)野生種群的種群遺傳多樣性進(jìn)行初步研究，為該寄生蜂的科學(xué)利用和蜂種合理復(fù)壯提供參考.

1 材料與方法

1.1 種群樣品的收集

本研究的樣品于2018—2019年在云南省11市州的煙田、繁蜂工廠和野外蔬菜田采集獲得，其中煙田種群(S)6個(gè)，工廠繁育種群(G)13個(gè)，野生種群(Q)1個(gè)(表1)，樣點(diǎn)的選擇覆蓋了云南主要植煙區(qū)域.野外煙蚜繭蜂種群的采集主要是通過采集被寄生的僵蚜，并置于網(wǎng)兜內(nèi)直到煙蚜繭蜂羽化，立即將其浸泡在無水乙醇中，每個(gè)僵蚜個(gè)體采集距離不低于5 m，回到實(shí)驗(yàn)室之后，更換一次無水乙醇，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存.標(biāo)本經(jīng)過形態(tài)和DNA條形碼鑒定后，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

表1 云南省主要煙區(qū)煙蚜繭蜂種群樣本的采集信息

1.2 基因組DNA提取和線粒體基因數(shù)據(jù)的獲取

將雌成蜂單頭樣本置于 2 mL 研磨管中，加入1大1小2個(gè)滅菌后的研磨珠，使用研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，tissuelyser-32)進(jìn)行研磨，最后使用天根血液/細(xì)胞/組織/基因組DNA提取試劑盒(DP304)進(jìn)行DNA的提取.基因組DNA構(gòu)建插入片段長(zhǎng)度為350 bp的2代測(cè)序文庫(kù)，利用Illumina NovaSeq 6000(北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司)平臺(tái)進(jìn)行150 bp雙端測(cè)序.原始測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后經(jīng)過質(zhì)量控制獲得clean data.以本課題組測(cè)序完成的煙蚜繭蜂線粒體基因組作為參考序列(GenBank登錄號(hào)：MT264907)，選取atp6、cox1、cob和nad2基因序列在測(cè)序數(shù)據(jù)中調(diào)取目的片段，利用Geneious 10.1.3(http://www.geneious.com)軟件“map to the reference”操作，參數(shù)設(shè)置為：最小重疊40 bp，最小序列相似度95%.利用MAFFT[28]軟件對(duì)所有個(gè)體的線粒體基因分別進(jìn)行同源比對(duì)，最后串聯(lián)為1個(gè)數(shù)據(jù)集用于種群遺傳多樣性的分析.

1.3 種群遺傳學(xué)分析

利用DnaSP5.10[29]軟件計(jì)算單倍型數(shù)(number of haplotypes, Ht)、單倍型多樣性(haplotype diversity, Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity, Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(average number of nucleotide differences, K)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(the number of polymorphic sites, S)等種群遺傳多樣性參數(shù).利用Arlequin3.5[30]軟件計(jì)算不同分組變異分布及分化系數(shù)(AMOVA)和種群遺傳分化指數(shù)(Fst).通過PopART1.7[31]軟件的中值鄰接法構(gòu)建單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)，利用IQTREE[32]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，堿基替代模型為自動(dòng)預(yù)測(cè)，并進(jìn)行1000次自展檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 煙蚜繭蜂的種群遺傳多樣性

煙蚜繭蜂4個(gè)線粒體蛋白質(zhì)編碼基因串聯(lián)后的總長(zhǎng)度為4,359 bp(GenBank登錄號(hào)：MT653697～654116).云南省20個(gè)種群105個(gè)個(gè)體中，共有10種單倍型，單倍型多樣性0.501、核苷酸多樣性0.00743、平均核苷酸差異數(shù)32.385、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)158.總的來看，核苷酸多樣性最高的是工廠繁育種群，最低的是煙田種群；而單倍型多樣性最高的是普洱野生種群，最低的是煙田種群(表2).

表2 云南省主要煙區(qū)煙蚜繭蜂種群遺傳多樣性參數(shù)

在6個(gè)煙田種群中，有3個(gè)沒有遺傳多樣性，另外3個(gè)種群核苷酸多樣性為0.000 69～0.006 61，昭通鎮(zhèn)雄(ZTZXS)和昆明宜良(KMYLS)種群核苷酸多樣性最高；在13個(gè)工廠繁育種群中，有9個(gè)種群沒有遺傳多樣性，保山騰沖(BSTCG)和麗江玉龍(LJYLG)種群具有較高的核苷酸多樣性，曲靖宣城(QJXWG)和紅河彌勒(HHMLG)種群核苷酸多樣性較低.整體上看，云南省主要煙區(qū)煙田和工廠繁育種群總體的遺傳多樣性偏低.

10種單倍型中，4個(gè)為共享單倍型，6個(gè)為獨(dú)有單倍型(圖1).煙田種群只有3種單倍型，均為共享單倍型，其中Hap6為煙田種群所獨(dú)有.工廠繁育種群有6種單倍型，其中3個(gè)為獨(dú)有單倍型(Hap2、Hap3、Hap7).煙田種群中楚雄永仁(CXYZS)、昆明宜良(KMYLS)、昭通鎮(zhèn)雄(ZTZXS)均有2種單倍型(Hap4和Hap5，Hap4和Hap6)，而同一州市的工廠繁育種群只有1種單倍型(Hap4).Hap4是11個(gè)種群的唯一單倍型，只有保山騰沖(BSTCG)、保山隆陽(yáng)(BSLYG)和云南普洱(YNPEQ)種群中沒有出現(xiàn).而保山騰沖(BSTCG)(Hap2、Hap3)和云南普洱(YNPEQ)(Hap8、Hap9、Hap10)2個(gè)種群中就有5種獨(dú)有單倍型，保山隆陽(yáng)(BSLYG)和云南普洱(YNPEQ)種群共享Hap1.

從單倍型數(shù)量和頻率來看，Hap4數(shù)量最多，共有73個(gè)個(gè)體，占所有樣本的69.5%，在17個(gè)種群均有出現(xiàn)，包含了所有的煙田種群和多數(shù)工廠繁育種群.其中Hap4在煙田種群中出現(xiàn)26次，占所有煙田樣本的86.7%，在工廠繁育種群出現(xiàn)47次，占所有工廠繁育樣本72.3%.

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)的結(jié)果一致，大致分為5支，各分支差異較大.云南普洱和保山騰沖種群的單倍型出現(xiàn)在關(guān)系較遠(yuǎn)的兩個(gè)分支上，保山2個(gè)工廠繁育種群的單倍型均與其它工廠繁育種群的單倍型親緣關(guān)系較遠(yuǎn).除保山外，其他煙田和工廠繁育種群?jiǎn)伪缎筒町愝^小.

圖1 云南省主要煙區(qū)煙蚜繭蜂種群?jiǎn)伪缎途W(wǎng)絡(luò)圖 圖2 云南省主要煙區(qū)煙蚜繭蜂種群?jiǎn)伪缎拖到y(tǒng)發(fā)育樹

2.2 煙蚜繭蜂的種群遺傳結(jié)構(gòu)

云南多數(shù)種群之間成對(duì)的種群遺傳分化系數(shù)沒有顯著性差異，且僅有同一單倍型，沒有任何分化.除了保山、曲靖、紅河僅有工廠繁育種群外，其他地區(qū)同州市的煙田種群與工廠繁育種群之間基本沒有分化，具有相同的遺傳背景；不同區(qū)域工廠種群間分化較低，差異不顯著(p<0.05)；野生種群(YNPEQ)與保山隆陽(yáng)種群(BSLYG)基本無分化(Fst=-0.079)，而與其他所有種群都有較大分化(Fst >0.5)，其中與11個(gè)種群(只有Hap4)的遺傳分化系數(shù)最大，為0.853 7；保山騰沖種群(BSTCG)與所有種群都有較大分化(Fst >0.5)，其中與11個(gè)種群(只有Hap4)的遺傳分化系數(shù)最大為0.789，與野生種群(YNPEQ)遺傳分化系數(shù)最小為0.582 5.

對(duì)6個(gè)州市的煙田和工廠繁育種群(楚雄、麗江、昆明、大理、文山、昭通)的AMOVA分子方差分析結(jié)果顯示，按照不同州市或煙田和工廠繁育種群不同類型劃分的群組之間均沒有顯著分化，表明變異主要來自單個(gè)種群內(nèi)部.由此可見，云南不同地區(qū)的煙田和工廠繁育種群具有較為一致的遺傳背景.

圖3 云南省主要煙區(qū)煙蚜繭蜂種群間分化系數(shù)(Fst)

表3 云南省主要煙區(qū)煙蚜繭蜂種群不同分組的遺傳變異AMOVA分析

3 討論

煙蚜繭蜂大規(guī)模擴(kuò)繁技術(shù)成熟，防治煙蚜效果顯著，但是種群衰退問題是限制煙蚜繭蜂應(yīng)用的重要因素[26].隨著煙蚜繭蜂防治煙蚜技術(shù)的全國(guó)推廣，越來越多的繁蜂工廠被建立，明確人工釋放對(duì)煙田種群遺傳多樣性的影響，對(duì)煙蚜繭蜂保護(hù)利用以及合理復(fù)壯有重要意義.云南省是我國(guó)煙草的主要種植區(qū)，也是最早開展煙蚜繭蜂工廠化繁育以及大規(guī)模釋放和推廣應(yīng)用的地區(qū)[20].了解云南工廠繁育和煙田種群的遺傳差異，可以為后續(xù)制訂科學(xué)有效的種群擴(kuò)繁、復(fù)壯和田間釋放策略提供參考依據(jù).

本研究中，半數(shù)煙田種群只有1種單倍型，對(duì)應(yīng)地區(qū)的工廠繁育種群大部分也沒有遺傳多樣性，全部19個(gè)煙田和工廠繁育種群中有17個(gè)種群都共享單倍型Hap4，該單倍型是分布最廣泛的，在9個(gè)州市的工廠繁育種群均有出現(xiàn)，但是野生種群的所有單倍型均與Hap4相距較遠(yuǎn)，變異較大.同時(shí)，分子方差分析結(jié)果也顯示煙田和工廠繁育種群遺傳分化低，遺傳背景相似，由此可見，煙田煙蚜繭蜂種群的遺傳多樣性與工廠繁育種群具有一致性，大規(guī)模釋放的煙蚜繭蜂在煙田能夠有效定殖，因此工廠繁育種群的遺傳多樣性反映了煙田種群的遺傳多樣性.不同州市間較低的遺傳分化表明，這9州市的蜂種可能具有同樣的來源，并且缺少野生親本的補(bǔ)充.保山的2個(gè)工廠繁育種群遺傳多樣性較高，且與云南普洱的野生種群共享Hap1，與Hap8、Hap9的關(guān)系較近，遺傳分化分析也顯示保山工廠繁育種群與普洱野生種群基本無分化，而與其他種群分化較高，因此，保山的蜂種可能經(jīng)歷了來自野生種群的復(fù)壯，種群的遺傳多樣性得到提升.在以往的研究中，人工繁育種群的遺傳多樣性顯著低于野生種群的現(xiàn)象在凡納濱對(duì)蝦、光裸方格星蟲、蘭州鲇等水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖以及大熊貓等珍稀動(dòng)物保護(hù)的研究中都有類似的報(bào)道[33-36]，但在天敵工廠化繁育及昆蟲研究中尚未有相關(guān)報(bào)道.在工廠化繁育中，由于缺少野生親本的補(bǔ)充，導(dǎo)致種群有效親本數(shù)量降低，近交幾率增加，遺傳多樣性喪失，種群衰退風(fēng)險(xiǎn)增大.而種群的衰退可能直接導(dǎo)致煙蚜繭蜂釋放到煙田后控害能力下降，達(dá)不到預(yù)期的生物防治效果.

本研究選取了4個(gè)線粒體蛋白質(zhì)編碼基因作為分子標(biāo)記，初步解析了云南省煙田煙蚜繭蜂種群遺傳多樣性的特點(diǎn)；總的來說，工廠繁育種群能夠在煙田有效定殖，但是長(zhǎng)期工廠化繁育可能對(duì)煙田和工廠種群的遺傳多樣性造成了一定影響，因此云南省主要煙區(qū)在繁育和釋放煙蚜繭蜂進(jìn)行生物防治時(shí)應(yīng)注意及時(shí)補(bǔ)充野生親本對(duì)蜂種進(jìn)行合理復(fù)壯，同時(shí)應(yīng)該開展長(zhǎng)期的遺傳多樣性監(jiān)測(cè)，警惕可能存在的種群衰退的風(fēng)險(xiǎn).線粒體基因具有進(jìn)化速率較快、母系遺傳、同源性高且易于分析等特點(diǎn)，在解析物種的種群遺傳結(jié)構(gòu)方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，但是線粒體基因由于其重要的功能往往受到較大的選擇壓力，在探究物種的適應(yīng)性進(jìn)化及其遺傳機(jī)制等方面作用不足，后續(xù)可使用基因組層次SNPs等高分辨力的分子標(biāo)記進(jìn)一步研究，在基因組水平更好地理解煙蚜繭蜂的種群分化格局和種群衰退的遺傳基礎(chǔ)等問題.此外，本研究中種群的樣本量較少，特別是缺少其他野生種群的樣本，因此不能確定大規(guī)模繁育和釋放對(duì)當(dāng)?shù)匾吧N群的影響，也不清楚云南省不同地區(qū)的野生種群分化程度如何，這需要后續(xù)進(jìn)一步的取樣分析.