表觀遺傳試劑誘導(dǎo)滇重樓內(nèi)生真菌Hypomyces sp.CLG4次生代謝產(chǎn)物的研究

婁水珠，朱婭寧，馬肖燕，李文義，杜剛，楊海英，汪偉光

(1.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650500;2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會-教育部重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650500)

植物內(nèi)生真菌是指存活于健康植物組織中，卻不會使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物[1]，它是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分.宿主植物與內(nèi)生真菌長期協(xié)同進(jìn)化，互利共生[2]，使得內(nèi)生真菌往往可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富的次生代謝產(chǎn)物.研究發(fā)現(xiàn)，在實驗培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌微生物天然產(chǎn)物代謝途徑的很多基因或基因簇都是沉默的.因此，激活這些沉默基因或基因簇將有可能產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物.如何激活植物內(nèi)生真菌中沉默的天然產(chǎn)物生物合成基因或基因簇成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)問題[3].

利用化學(xué)表觀遺傳學(xué)方法來發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物是一種有效的策略，其機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等[4].其中，組蛋白去乙?；敢种颇軌蚴菇M蛋白去乙?；?、染色質(zhì)卷縮，抑制轉(zhuǎn)錄，沉默基因，抑制細(xì)胞內(nèi)多種信號通路、凋亡相關(guān)基因以及細(xì)胞黏附轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)，激活沉默基因[5]，代表修飾劑有伏立諾他、帕比司他、恩替諾特和西達(dá)本胺等.研究表明，通過化學(xué)表觀遺傳修飾，可以改變真菌次級代謝的分子機(jī)制，達(dá)到基因沉默或基因表達(dá)的目的[6-7].Cichewicz課題組于2008年最先提出運(yùn)用化學(xué)表觀遺傳修飾劑來抑制真菌中影響表觀遺傳的酶類激活一些沉默基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)真菌能產(chǎn)生未知的次級代謝產(chǎn)物，并且分離得到結(jié)構(gòu)新穎的骨架[8].2011年Asai對2株昆蟲內(nèi)生真菌Torrubiellaluteorostrata和Cordycepsannullata進(jìn)行了化學(xué)表觀遺傳修飾劑作用下的研究，得到3個結(jié)構(gòu)新穎的新化合物色氨酸異戊二烯類化合物[9].2013年Asai研究組在對1株由芍藥的葉片中分離得到的植物內(nèi)生真菌Graphiopaischlorocephala的研究中，在其培養(yǎng)基中添加煙酰胺進(jìn)行發(fā)酵，最終從發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了3個二苯甲酮類化合物[10]，該系列化合物均具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu).本課題組前期也從滇重樓內(nèi)生真菌分離得到Phomopsissp. 0391對其進(jìn)行組蛋白脫乙酰酶抑制劑誘導(dǎo)，得到新化合物13-angeloyloxy-diplosporin[11]以及雜色曲霉Aspergillusversicolor0312中的過表達(dá)產(chǎn)生新的化合物versicolor A.

本文對采自云南省呈貢區(qū)的野生重樓樣品中的1株菌寄生屬 (Hypomyces) 內(nèi)生真菌H. sp. CLG4 進(jìn)行了化學(xué)表觀遺傳學(xué)誘導(dǎo)發(fā)酵，對誘導(dǎo)后的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到6個化合物 (圖1)，化合物1～3、5和6為首次從滇重樓內(nèi)生真菌中分離得到.研究表明，該方法為激活藥用植物內(nèi)生真菌，獲取更多結(jié)構(gòu)多樣的天然產(chǎn)物提供了一定參考.

圖1 CLG4表觀遺傳學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

高效液相色譜Aglient 1200 (美國Aglient公司);Avance III HD 600 (德國Bruker公司);Avance III HD 800 MHz (德國Bruker公司);Agilent，ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×9.4 nm, 5 μm, Aglient公司)，LDZX-40B 立式自動電熱蒸汽滅菌鍋 (上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SW-CJ-ZFD 型無菌操作臺 (蘇凈集團(tuán)安泰公司);HP-900 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 (廣東省醫(yī)療器械廠);ZHWY-2102 恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海智城分析儀器制造有限公司);SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 (鞏義市英峪予華儀器廠);S20092819 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮).

1.2 實驗材料

柱層析法使用硅膠 (200～300目，青島海事)、恩替諾特 (湖北信康醫(yī)藥化工有限公司)、RP-18凝膠 (40～63 μm，YMC)、乙腈 (色譜純)、甲醇 (色譜純)、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、娃哈哈純凈水、二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮(均為工業(yè)級)、DMSO為分析純.

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基 (PDA) (1L)：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 300 g，瓊脂 18 g，蒸餾水 1 000 mL, 121 ℃ 滅菌 20 min，冷卻備用.

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基 (PDB) (1L)：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 300 g，蒸餾水 1 000 mL, 121 ℃ 滅菌 20 min，冷卻備用.

恩替諾特終濃度為 500 μmoL/mL.

1.3 菌株的來源和鑒定

野生重樓采自云南省呈貢區(qū)梁王山的野生重樓，經(jīng)云南民族大學(xué)杜剛副教授鑒定為滇重樓(P.polyphyllavar.yunnanensis).經(jīng)實驗室分離鑒定，菌寄生屬內(nèi)生真菌 (H.sp. CLG4) 菌株從新鮮的重樓根部分離，且經(jīng)分子克隆手段鑒定，其ITS NCBI登錄號為：MT604986,菌株保存于云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實驗室.

1.4 菌株表觀遺傳篩選及發(fā)酵

將常溫條件下保藏的菌株取出，經(jīng)平板活化后備用.配制馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)(PDB)，按照 10∶1 的接種量進(jìn)行接種.于 30 ℃ 200 r/min 的條件下培養(yǎng) 3 d，將種子液分別接種2瓶 100 mL PDB培養(yǎng)基中，控制其他條件一致，空白組不加恩替諾特，實驗組加入 100 μL 恩替諾特，培養(yǎng) 3 d.無菌條件下，取出 1 mL 菌液，乙酸乙酯萃取2次，每次 500 μL 乙酸乙酯，2次萃取的乙酸乙酯濃縮蒸干后用 100 μL 色譜甲醇溶解，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清 10 μL 進(jìn)行HPLC分析 (0～ 30 min，乙腈10%～100%梯度；流速 1 mL/min，進(jìn)樣體積 10 μL).發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生很多次生代謝產(chǎn)物，因此，以試驗組同樣條件擴(kuò)大發(fā)酵 10 L.

1.5 CLG4次級代謝產(chǎn)物分離純化

發(fā)酵液 10 L，用多層紗布過濾，分離得到濾液和菌絲體.濾液用等體積的乙酸乙酯萃取6次，菌絲體用丙酮超聲提取，提取液濃縮至無丙酮后所得的水相再用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并兩部分的乙酸乙酯萃取物，在 40 ℃ 下減壓蒸餾得浸膏 15 g，經(jīng)硅膠柱 (200～300目) 層析，分別以純二氯甲烷、V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=(100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、1∶1)、純甲醇梯度洗脫，得到Fr.1～Fr.10，共10個組分.Fr.2以石油醚-乙酸乙酯溶劑體積比系統(tǒng)梯度洗脫，通過硅膠柱色譜反復(fù)純化得到化合物3(12.2 mg).Fr.3以二氯甲烷-甲醇溶劑體積比系統(tǒng)梯度洗脫，通過硅膠柱色譜，RP-18反向柱反復(fù)純化得到化合物1(109.0 mg)，6(114.4 mg)，4(19.5 mg)，F(xiàn)r.4以石油醚-乙酸乙酯溶劑體積比系統(tǒng)梯度洗脫，二氯甲烷-甲醇溶劑體積比系統(tǒng)梯度洗脫，通過硅膠柱色譜反復(fù)純化得到化合物5(28.3 mg)，2(10.1 mg).

2 結(jié)果與分析

2.1 表觀遺傳篩選結(jié)果

利用恩替諾特對菌株進(jìn)行表觀遺傳學(xué)篩選.對比空白組和實驗組 (加入恩替諾特)，HPLC在 210 nm 處檢測發(fā)現(xiàn)菌株CLG4最敏感，如圖2所示.

圖2 CLG4代謝物HPLC分析圖

對比上述2組實驗結(jié)果，可以看出加入恩替諾特后，CLG4的代謝產(chǎn)物組成發(fā)生顯著變化，產(chǎn)生新的產(chǎn)物峰1～6.

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物2黃色固體，分子式C11H12O5,1H NMR(800 MHz,Acetone-d6)δ: 1.50 (3H,d,J=6.3Hz,3-CH3),2.87 (1H,m,H-4a),2.96 (1H,dd,J=16.2,3.2 Hz,H-4b),3.90 (3H,s,7-OCH3),4.72 (1H,m,H-3),6.53 (1H,s,H-5),11.05 (1H,s,8-OH).13C NMR (200 MHz,Acetone-d6)δ: 20.8 (CH3-3),34.6 (C-4),56.5 (OCH3-7),77.1 (C-3),103.0 (C-8a),103.2 (C-5),132 (C-7),133.7 (C-4a),151.1 (C-8),154.0 (C-6),170.9 (C-1).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道的數(shù)據(jù)基本一致，因此鑒定為6-demethylkigelin.

化合物5黃色固體，分子式C7H8O2,1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.58 (1H,d,J= 8.5 Hz,H-6),6.45 (1H,dd,J= 8.5,2.9 Hz,H-5),6.54 (1H,d,J= 2.9 Hz,H-3),2.12 (3H,s,CH3).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:149.3 (C-1),126.5(C-2),116.4 (C-3),150.9 (C-4),113.9(C-5),118.4(C-6),16.4(CH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道一致，因此鑒定為pyrolin.

3 結(jié)語

本實驗采用組蛋白去乙?；揎梽┒魈嬷Z特(Entinostat)對滇重樓內(nèi)生真菌CLG4(Hypomyces.sp)進(jìn)行化學(xué)表觀遺傳誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)與未誘導(dǎo)的滇重樓內(nèi)生真菌有顯著差別.對誘導(dǎo)后的菌株產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物分離純化，得到6個化合物，化合物1～3，5和6為首次從該內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中分離得到.化合物2為terrein，它是青霉和曲霉真菌的著名代謝物，具有廣譜的生物活性，如抗菌、抗腫瘤和酶抑制作用[13]；化合物3為(3R)-6-methoxymellein，它是一種常見的植物抗毒素，由胡蘿卜根產(chǎn)生，這種化合物具有廣泛的抗菌譜，能抑制幾種真菌的生長，如酵母菌和細(xì)菌[14]；化合物4為(3R)-6,7-dimethoxymellein，它對人類病原真菌 (皮膚癬菌)、犬小孢子菌和長毛癬菌具有顯著的抗真菌活性[14]；化合物6為6-demethylkigelin，它能抑制生長[16].研究結(jié)果表明，化學(xué)表觀遺傳誘導(dǎo)方法，可使真菌的代謝產(chǎn)物類型發(fā)生顯著改變，推測這是表觀遺傳修飾劑誘導(dǎo)改變真菌代謝途徑的結(jié)果.表觀遺傳誘導(dǎo)為研究藥用內(nèi)生真菌在實驗室培養(yǎng)條件下產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物提供了一定借鑒.