新型基因編輯技術在單細胞微藻中的應用進展

曹豪豪,張紅兵*,薛溪發(fā),李左群,閆洪波,李會宣

1.河北經貿大學生物科學與工程學院, 石家莊 050061;2.河北德諾商品檢測技術服務有限公司, 石家莊 050061

當前化石能源短缺及其應用帶來的污染日趨嚴重，阻礙了世界經濟發(fā)展，研發(fā)替代能源勢在必行，生物燃料作為可再生的能源形式潛力巨大，成為研究焦點[1]。微藻是自然界中起源最早、數量最多、分布最廣的生物種類，是含有葉綠素a的光合作用微生物。由于許多種屬的微藻在生長過程中能在細胞內大量積累生物質，已用于生產沼氣、乙醇、生物柴油、生物氫等環(huán)保、清潔、經濟的生物燃料，是化石燃料的理想替代品，同時利用藻類生物質生產食品和飼料添加劑乃至藥物等也引起了廣泛關注[2]。

為了充分發(fā)揮微藻生產潛力、優(yōu)化生產工藝，有必要利用分子生物學技術研究微藻的遺傳背景，解決脂質積累率偏低[3]、固定二氧化碳效率差[4]、培養(yǎng)周期長[5]等瓶頸問題。由于生物信息學和基因工程技術的迅速發(fā)展，尤其是新型基因編輯技術，已經成為解決上述問題的重要策略。其中，應用最廣泛的是TALEN和CRISPR/Cas9 等基因編輯技術，在哺乳動物、植物等中已取得了較好的效果[6]。基于此，本文就上述技術在微藻遺傳改造方面的應用進行綜述，以期為相關研究提供借鑒。

1 基因組編輯技術

基因組編輯技術的核心是通過對生物體特定DNA片段的插入、敲除、修飾或替換等手段，使預期基因組序列發(fā)生改變并遺傳，進而實現(xiàn)目標基因的編輯[7]。該方法不僅可以研究目的基因的功能，還可以賦予生物體新的生物學特性。特別是近幾年被稱為分子剪刀的工程核酸酶,極大地促進了基因組編輯的發(fā)展，包括鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)、轉錄激活物樣效應因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和簇狀規(guī)則間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas(CRISPR-associated systems)核酸酶系統(tǒng)。

1.1 ZFN技術

目前應用的ZFN是一類人工合成的核酸內切酶，也就是具有特定基因編輯功能的蛋白質，由3個人工設計的鋅指DNA結合結構域和1個FokⅠ核酸酶結構域組成，能特異剪切基因組某段DNA[8]。

ZFN的N末端是DNA的結合域，一般含3～4個串聯(lián)的CysHis2鋅指蛋白，其中每個鋅指蛋白能夠結合特定靶DNA序列中3 bp的片段；C末端多為非特異性FokⅠ核酸酶結構域，具有核酸內切酶活性，能夠切割非特異DNA，切割時FokⅠ的催化結構域需要以適當的堿基距離形成異二聚體。如圖1所示，為了進行有效的二聚化和切割，2個ZFN分子以尾對尾方式與相對鏈上的靶DNA結合，相間隔5～7 bp，在此間隔區(qū)中可以實現(xiàn)特定DNA位點的切割[10]。

1.2 TALEN技術

TALEN的DNA結合結構域源自轉錄激活子樣效應物(transcription activator-like effector，TALE)，該效應物是源于植物病原菌黃單胞菌屬(Xanthomonas)[11]。

與ZFN相似，TALEN也包含2個結構域：N端為DNA特異性識別和結合區(qū)域TALE，C端為與ZFN相同的FokⅠ核酸酶催化結構域。其中TALE由N端轉錄信號、C端核定位信號、轉錄激活結構域以及DNA特異性識別和結合結構域組成。在TALE蛋白的轉錄激活結構域中含有由34個氨基酸組成的鋅指模塊同源重復序列，其中第12、13位為重復可變的雙氨基酸殘基(repeat variant diresidues，RVD)。TALE所識別的堿基是由不同的RVD所決定的，其中NI識別A、NG識別T、NH識別G、NN識別A或G、HD識別C、NS對4種堿基都可以識別，因此經過人工編輯TALE的RVD，能夠識別對應的DNA序列。FokⅠ結構域來自FokⅠ核酸酶的末端活性域，需要二聚化才有活性。所以，在基因編輯的過程中需要2個TALEN蛋白，如圖2所示，目標序列的上游與下游由2個TALE結構域分別識別，2個FokⅠ結構域作用在一段DNA上造成雙鏈斷裂，可以在該位點進行插入、敲除或點突變等操作[13-15]。

1.3 CRISPR/Cas技術

CRISPR/Cas系統(tǒng)是在細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA[16-18]。CRISPR即成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列，而 Cas 即 CRISPR 相關系統(tǒng)，位于 CRISPR序列的上游，包含多種功能蛋白基因[19]。

CRISPR是其中的靶位點識別組件，CRISPR轉錄生成CRISPR-RNA前體(pre-crRNA)，隨后前體被加工成短的成熟的CRISPR-RNA(crRNA)，crRNA將與靶基因DNA通過堿基互補配對進行識別。切割DNA的組件為Cas核酸內切酶，CRISPR與Cas結合形成一種RNA-蛋白質的復合體，RNA特異性識別結合DNA，并引導Cas核酸酶特異性切割DNA[20]。

CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)可分為TypeⅠ型、TypeⅡ型和Type Ⅲ型3種類型。其中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)CRISPR/Cas9是目前研究最為充分的系統(tǒng)，如圖3所示，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，向導RNA(guide RNA，gRNA)代替了上述crRNA和tracrRNA兩者的作用，在gRNA的作用下，識別靶序列的原型間隔區(qū)相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)位點并引導Cas9核酸酶切割靶位點，通過非同源末端連接或同源重組進行修復以實現(xiàn)基因的敲除與修飾[22-23]。此外，Cas9蛋白還可在2個活性位點殘基(D10A和H840A)發(fā)生突變，失去啟動DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSBs)的能力，形成所謂的CRISPR/dCas9系統(tǒng)，可用于干擾和激活基因表達[24]。表1比較了3種編輯技術的優(yōu)缺點。

圖1 ZFN的作用機制[9]Fig.1 The mechanism of ZFN[9]

圖2 TALEN的作用機制[12]Fig.2 The mechanism of TALEN[12]

圖3 CRISPR/Cas9工作機制[21]Fig.3 The mechanism of CRISPR/Cas9[21]

表1 新型基因編輯技術的比較Table 1 Comparison of new gene editing technologies

2 基因編輯技術在微藻中的應用

理論上，上述工具酶可以定點修飾任何物種的基因序列。它們結合到靶基因序列后，通過切割酶破壞靶DNA雙鏈，然后啟動非同源末端連接修復(nonhomologous end joining, NHEJ)或同源重組修復(homology-directed repair,HDR) 機制來修復靶基因，從而產生精確的定點修飾的靶基因而沒有插入任何外源DNA片段，這種定點修飾就成為可以在后代中穩(wěn)定遺傳的變異[25]，在微藻中同樣適用。

2.1 ZFN技術在微藻中的應用

ZFN技術應用于微藻的研究非常少，只有1例。2013年，Sizova等[26]首次將ZFNs技術應用于萊茵衣藻(Chlamydomonasrehardtii，常作為基礎和生物技術研究的通用模型)，利用ZFNs靶向突變編碼光敏一型視紫紅質離子通道的COP3基因。ZFN的不同轉化效率是由敲除抗性或熒光標記等報告基因來評估的，并根據結果修飾優(yōu)化模塊組合，選出親和力和特異性最佳的核酸酶結合外源DNA共轉化，實現(xiàn)對該藻株靶基因的定點敲除。這項技術不僅有助于衣藻單個基因功能的研究，而且還可以實現(xiàn)有效的基因定點修飾。

2.2 TALEN技術在微藻中的應用

TALEN誘導的靶向基因失活和靶向序列插入的方法，通過重塑硅藻新陳代謝方面的有效性在微藻中得到了證實。Daboussi等[27]首次將 TALEN 技術應用于硅藻的基因敲除。通過NHEJ介導的修復產生突變體，敲除了三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中參與油脂代謝的關鍵基因，其中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UCPase)基因的敲除突變株的甘油三酯(triacylglycerol, TAG)含量相比野生型藻株提高了45倍，使突變體具有工業(yè)生產的潛力。

之后的研究中，將TALEN表達盒與含有與TALEN靶位點同源序列側翼的抗生素抗性基因的“敲除質?！苯Y合， TALEN與靶基因結合進行切割, “敲除質粒”則通過HDR整合到基因組, 敲除三角褐指藻P.tricornutum的尿素酶基因, 基于HDR的靶向插入更易獲得突變體[28]。Hao等[29]通過TALEN基因組編輯技術破壞了P.tricornutum中硫酯酶基因，成功構建了ptTES1基因的敲除突變株，結果表明盡管微藻生長受到損害，但與野生型菌株相比，ptTES1基因敲除突變體顯示出更高的TAG生產率，含量提高了1.7倍，證明了TALEN介導的靶基因敲除作為增強含油硅藻中TAG產生的有效策略的潛力。在最近的研究中，Kurita等[30]合成了編碼為產油微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)的Platinum TALENs，并通過在人HEK293T細胞中的單鏈退火實驗驗證了它們的DNA結合活性。以硝酸還原酶基因NoNR和?；D移酶基因LPAT1為靶點，將Platinum TALEN的多合一表達載體轉染到微綠球藻中。在N.oceanica候選位點沒有可檢測到的脫靶突變。同時引入TALENs靶向2個基因，獲得雙突變株。此外，這些多合一的TALEN載體在大腸桿菌中表現(xiàn)出高特異性和多重性。此研究為創(chuàng)造高性能藻類生物柴油的實際應用做出了貢獻。

2.3 CRISPR/Cas9技術在微藻中的應用

首次應用CRISPR/Cas9對微藻的研究中，Jiang等[31]將Cas9蛋白和sgRNA(simple guide RNA，sgRNA)基因通過電穿孔導入衣藻細胞的實驗，用非同源末端連接系統(tǒng)修復雙鏈斷裂，采用CRISPR/Cas9對微藻中的4個靶基因進行插入和缺失，成功在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) 細胞中表達Cas9蛋白與sgRNA，突變頻率達42.8%。然而，由于Cas9的毒性，未能獲得任何穩(wěn)定遺傳的轉化子，嚴重降低了成功率。隨后有研究表明，通過運送包含Cas9蛋白和sgRNAs的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNPs)解決了這個問題，以避免與載體驅動的Cas9表達相關的細胞毒性和脫靶問題。在MAA7、CpSRP43和ChlM這3個位點獲得了CRISPR/Cas9誘導的突變，與首次報道的轉基因Cas9誘導突變相比，靶向誘變效率提高了100倍，通過使用Cas9 RNPs大大提高了基因敲除效率[32]。

Wang等[33]以硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)為例，在工業(yè)產油性海洋微綠球藻(Nannochloropsisspp.)中建立了一種精確基因組編輯方法，用質粒載體介導的CRISPR/Cas9 技術敲除了微藻的1個硝酸還原酶基因，發(fā)現(xiàn)5 bp缺失突變體的比例超過1%，分離的突變體在NH4Cl作用下能正常生長，但在NaNO3作用下不能正常生長，是一個很有價值的轉NR基因的基礎菌株。有研究報道了在海洋微綠球藻中用CRISPR-Cas介導的基因組編輯的另一種方法：將RNP和編輯模板通過電穿孔直接導入微藻細胞，使Cas的表達可有可無，同源定向修復成為可能。Cas/RNPs與dsDNA修復模板的共導入有效地提高了靶位點的同源同組，產生了約70%的陽性突變系，陽性突變株比例顯著提高，有利于高效產生微綠球藻靶向突變體[34]。

海洋硅藻是真核微藻，在海洋中具有重要的生態(tài)作用，所以更需要建立簡單的CRISPR/Cas9體系。Nymark等[35]在三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中開發(fā)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，經優(yōu)化后實現(xiàn)了穩(wěn)定的靶基因敲除。該系統(tǒng)發(fā)揮功能需要的2個組分，Cas9核酸酶和引導核酸酶指向特定DNA序列的引導RNA，都可以在同一載體中表達，結果在26個轉化實驗中有8個得到了突變子，突變頻率為31%。Moosburner等[36]提出了改進方法，改進后單基因和雙基因突變細胞系都是通過將1個選擇性Cas9和1個或2個sgRNAs接合后引入硅藻，同時利用陰性和陽性選擇的外顯子克隆策略，再利用人工測序、潮汐測序分析和T7核酸內切酶分析，開發(fā)了細胞系篩選和基因分型策略，縮短產生突變體所需時間，結果單基因和雙基因敲除細胞系的突變率分別為48%和25%。

從微藻提煉油脂是解決石油枯竭和二氧化碳排放問題的一種可選擇、可持續(xù)、有前途的發(fā)展趨勢。鑒于微藻細胞生長和油脂含量的限制，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行改造具有重要意義。Lin等[37]證明農桿菌介導的質粒適合對小球藻(Chlorellavulgaris)進行基因插入，并以ω-3脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase 3，F(xiàn)ad3)基因為基礎構建了結構類似的含有Cas9片段的質粒，該片段含有設計在Fad3基因上的sgRNA，在小球藻FSP-E中表達脂質含量高達46%，這是首次成功將CRISPR/Cas9技術用于小球藻基因操作的案例。

本課題組目前正在進行微藻的相關研究，獲得了帶有 G418 抗性的Cas9質粒，將重組質粒成功轉化到小球藻，為CRISPR/Cas9技術應用于小球藻提供參考[38]。

3 展望

ZFN和TALEN都是蛋白識別機制，CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別機制則是通過人工設計的sgRNA實現(xiàn)，操作簡便，便于上手，容易構建。此外，CRISPR/Cas基因組編輯的效率和精確度通過不斷的努力得到了提高，包括Cas蛋白和sgRNA的不同表達策略，因而成為了主流的基因組編輯技術。

目前，基因組編輯技術主要是產生內源基因功能缺失的突變體，對基因定點替換及基因的定點插入仍具有極大的挑戰(zhàn)性，無法做到對任一位點上高效地替換或插入任意序列，這就限制了基因組編輯技術在微藻中的應用。與此同時，微藻本身還有很多問題，由于它們獨特的細胞壁和表面結構，很難將遺傳物質轉入細胞中，通常需去除細胞壁并使用原生質體轉化，從而提高轉化效率。微藻可能在轉錄或轉錄后水平上對引入的遺傳物質(包括DNA和RNA)具有沉默機制，暫時抑制其中一個沉默組件可以提高其轉化效率。

隨著基因工程技術、生物信息學的飛速發(fā)展，微藻遺傳背景日趨明晰，對微藻進行基因改造已成為現(xiàn)實。新型基因編輯技術僅在萊茵衣藻、三角褐指藻、海洋微綠球藻等幾種微藻模型中進行了實驗，通過基因組、轉錄組學等方法對某些潛在菌株進行全面分析,深入研究將充分發(fā)揮新型基因編輯技術在更多微藻中的應用潛力，以更有效和更可行的方式從微藻中生產生物燃料或其他有價值的產品，有可能徹底改變未來高效和精確的基因工程解決方案，具有無可比擬的優(yōu)勢和發(fā)展前景。