海南紅樹林淡紫擬青霉胞外多糖提取條件的優(yōu)化

王竹,余善君,吉林佳,李詠婷,楊傳雄,黃燕妮

海南醫(yī)學(xué)院, 教育部熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, ?？?571199

多糖作為重要的生物活性物質(zhì)，已被證實(shí)具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性，在醫(yī)藥、食品、保健品及化妝品等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2]。海洋微生物由于生活在高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)、低溫等極端環(huán)境中，能夠產(chǎn)生比陸生生物活性更獨(dú)特的多糖類化合物。Kokoulin等[3]發(fā)現(xiàn)居海嗜冷桿菌的莢膜多糖可抑制白血病細(xì)胞增殖；Durairajan等[4]發(fā)現(xiàn)海洋來(lái)源的殼聚糖可抑制尿路感染致病性大腸桿菌的群體感應(yīng)能力，抑制生物膜的形成，為無(wú)抗生素治療尿路感染提供了可能。研究發(fā)現(xiàn)海洋多糖尤其是微生物來(lái)源的胞外多糖多為含一定比例半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等的雜多糖，不僅結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且活性獨(dú)特，已成為多糖類活性物質(zhì)的重要來(lái)源[5]。

淡紫擬青霉菌(Paecilomyceslilacinus)屬于半知菌綱(Deuteromycetes)絲孢菌目(Cnidosporales)的擬青霉屬(Paecilomyces)，為土壤習(xí)居菌，具有較高的藥用和環(huán)境保護(hù)價(jià)值。最佳生長(zhǎng)條件為15～30 ℃、pH 6～9的黑暗環(huán)境或黑暗與光照交替的環(huán)境[6]。其分泌的毒素、蛋白酶、多糖等次級(jí)代謝產(chǎn)物具有殺蟲、抑菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降解重金屬及農(nóng)藥殘留等功能，為目前極具推廣潛力的生防菌及功能菌[7-11]。史懷等[6]對(duì)淡紫擬青霉胞外多糖EP-1進(jìn)行了結(jié)構(gòu)研究，發(fā)現(xiàn)其是以β-(1,3)糖苷鍵連接而成的無(wú)分枝葡聚糖，對(duì)尖孢鐮刀菌具有很好的抑制作用。紅樹林淡紫擬青霉由于長(zhǎng)期生活在極端海洋環(huán)境中，具有產(chǎn)生獨(dú)特活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力。本課題組前期從海南沿海紅樹林中分離鑒定了一株淡紫擬青霉，其產(chǎn)生的胞外多糖具有一定的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可抑制HSV-1的吸附和生物合成，并刺激抗病毒免疫[12-14]。但胞外多糖的提取易受多種因素的影響，提取條件不當(dāng)會(huì)對(duì)多糖的提取率有較大影響，如乙醇沉淀法提取多糖過(guò)程中易受發(fā)酵液超濾濃縮倍數(shù)、三氯乙酸終濃度、乙醇終濃度等提取條件的影響[15-16]。為探討該淡紫擬青霉胞外多糖的最佳提取方案，本研究擬通過(guò)改變醇沉法提取過(guò)程中發(fā)酵液的超濾濃縮倍數(shù)、乙醇終濃度、沉淀時(shí)間和溫度、三氯乙酸終濃度等影響多糖提取率及蛋白脫除率的常見因素，觀察提取效果，以建立可靠、穩(wěn)定的胞外多糖提取方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 改良馬丁培養(yǎng)基和改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；95%濃硫酸(分析純，批號(hào)：20120301-1) 購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；100%三氯乙酸(分析純，批號(hào):2015032)購(gòu)于天津市福晨化學(xué)試劑廠；95%乙醇(批號(hào):150116)、苯酚(分析純，批號(hào)：150116)、葡萄糖(分析純，批號(hào):1707241)購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司；3.5 kD透析袋購(gòu)于華美生物工程公司；總蛋白(TP)測(cè)定試劑盒購(gòu)于長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器 恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-200H)購(gòu)于上海智城分析儀器制造有限公司；電子天平(PL203)購(gòu)于梅特勒-托利多儀器上海有限公司；離心機(jī)(Eppendorf 5810ZH061219)購(gòu)于艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司；生物安全柜(SG403A-HE)購(gòu)于Baker公司；CO2培養(yǎng)箱(MCO-18AC)購(gòu)于松下電器有限公司；紫外可見光分光光度計(jì)(T6)購(gòu)于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1淡紫擬青霉菌發(fā)酵培養(yǎng) 淡紫擬青霉傳代后接種于陳海水配制的馬丁液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩發(fā)酵培養(yǎng)一周。3 000 r·min-1，離心15 min，取上清液備用。

1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量[17]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法如下：精確稱取105 ℃干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖1 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，稀釋10倍，制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每0.1 mL中含葡萄糖10 mg。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品液10、20、30、40、50、60 μL分置于具塞試管內(nèi)，加蒸餾水至體積0.5 mL，加入5%苯酚0.2 mL，濃硫酸1.25 mL，混勻。置沸水浴中加熱5 min后，迅速冷卻至室溫。蒸餾水調(diào)零，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品液的吸收度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3發(fā)酵上清液濃縮倍數(shù)對(duì)多糖提取率的影響 等體積發(fā)酵液分裝到5個(gè)錐形瓶中，除一瓶外其余分別濃縮至原體積的1/2、1/3、1/4、1/5，分別加入等體積95% 冰乙醇，置4 ℃、24 h后13 000 r·min-1，4 ℃，離心45 min，沉淀用50% 乙醇洗滌2次后裝入透析袋內(nèi) (截留分子量3.5 kD)，去離子水透析3 d, 每8 h換1次水, 苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，計(jì)算提取率，以確定多糖提取時(shí)的最佳超濾濃度倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。多糖提取率(%)=沉淀粗多糖含量/(原發(fā)酵液體積×發(fā)酵液多糖含量)。

1.2.4三氯乙酸終濃度對(duì)蛋白脫除率的影響

在等體積發(fā)酵液中加入三氯乙酸至終濃度為 2%、4%、6%、8%、10%，4 ℃放置 24 h，離心取上清, 等體積定容，總蛋白測(cè)定試劑盒分別測(cè)定上清和發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白脫除率。蛋白脫除率(%)=(發(fā)酵液中蛋白含量-離心上清液中蛋白含量)/發(fā)酵液中蛋白含量×100%。

1.2.5乙醇終濃度對(duì)多糖提取率的影響 于發(fā)酵液中分別加入等體積、2、3、4和5倍體積的95% 冰乙醇，置4℃ 沉淀24 h，離心棄上清，50% 乙醇洗滌沉淀2次后裝入透析袋內(nèi)透析，苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，方法同1.2.3，計(jì)算提取率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6沉淀溫度對(duì)多糖提取率的影響 發(fā)酵液中加入等體積95% 的冰乙醇，分別置于4、8、16、25和37 ℃ 沉淀 24 h，離心后用50%的乙醇洗滌沉淀2次，透析和多糖含量檢測(cè)同1.2.3。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7沉淀時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 取等體積95% 冰乙醇加入發(fā)酵液中，置4 ℃分別沉淀12、16、20、24和28 h，離心，沉淀用50% 的乙醇洗滌2次，透析和多糖含量檢測(cè)方法同1.2.3。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8多糖提取率的正交試驗(yàn) 以95%乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù))、沉淀溫度、沉淀時(shí)間為影響因素, 以多糖提取率為指標(biāo), 設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，確定乙醇沉淀法最適提取條件, 試驗(yàn)因素水平見表1。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，計(jì)算多糖提取率，取其平均值。并對(duì)正交試驗(yàn)獲得的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor levels of L9(34) orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，得y=11.789x-0.190，R2=0.970，線性關(guān)系良好。

2.2 發(fā)酵液濃縮倍數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

將等體積發(fā)酵液濃縮后再提取多糖，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液濃縮倍數(shù)對(duì)多糖提取率有較大影響，結(jié)果見圖2，原體積發(fā)酵液多糖提取率最低，為40.295%±3.915%，濃縮2倍后多糖提取率升至48.915%±2.761%，濃縮3、4和5倍時(shí)提取率明顯升高，分別為56.191%±2.338%、57.903%±2.742%、56.849%±2.181%，發(fā)酵液濃縮4倍時(shí)多糖提取率最高，與原體積和濃縮1倍時(shí)的多糖提取率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而發(fā)酵液濃縮3、4和5倍時(shí)多糖提取率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，因此選擇3倍濃縮倍數(shù)作為多糖提取的發(fā)酵液濃縮倍數(shù)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

圖2 發(fā)酵液濃縮倍數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of concentrated ratio of fermentation liquor on the polysaccharides extraction

2.3 三氯乙酸終濃度對(duì)蛋白脫除率的影響

在等體積發(fā)酵液中加入三氯乙酸至終濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%，觀察不同濃度三氯乙酸對(duì)蛋白脫除率的影響，結(jié)果見圖3。隨著三氯乙酸終濃度增加，蛋白脫除率亦逐漸增加，終濃度10% 時(shí)蛋白脫除率達(dá)到高峰，為80.946%±2.966%，與終濃度 2%、4%、6% 時(shí)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但與終濃度8%時(shí)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此選擇10%的三氯乙酸濃度作為多糖提取的三氯乙酸濃度。

圖3 三氯乙酸終濃度對(duì)蛋白脫除率的影響Fig.3 Effect of concentration of trichloroacetic acid on removal rate of proteins from fermentation supernatant

2.4 乙醇用量對(duì)多糖提取率的影響

發(fā)酵液中的多糖分別用等體積、2、3、4和5倍體積95%的冰乙醇沉淀24 h，離心后洗滌、透析，苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，其收率分別為 46.673%±1.559%、51.130%±2.441%、58.150%±1.847%、59.271%±2.353%和60.363%±2.278%，可見5倍體積95%乙醇對(duì)多糖的沉淀效果最好，與等體積和2 倍體積相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但與3、4倍體積相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且等體積與2倍體積乙醇相比，3倍體積與4倍體積乙醇相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)，因此選擇3倍體積乙醇為多糖提取的乙醇終濃度。

圖4 乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the polysaccharides extraction

2.5 沉淀溫度對(duì)多糖提取率的影響

等體積95% 冰乙醇分別于4、8、16、25和37 ℃沉淀發(fā)酵液中的多糖，發(fā)現(xiàn)隨著沉淀溫度的升高，多糖的收率逐漸降低(圖5)，4 ℃ 時(shí)糖的收率最高，為46.336%±1.761%，8 ℃ 時(shí)為45.846%±1.409%，但二者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；沉淀溫度為16、25和37 ℃ 時(shí)糖的收率分別為42.502%±1.604%、41.970%±1.265%和40.924%±1.605%，三者之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與沉淀溫度4和8 ℃ 時(shí)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此選擇4 ℃為多糖提取的沉淀溫度。

2.6 沉淀時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

發(fā)酵液中加入等體積95% 冰乙醇后置4 ℃分別沉淀12、16、20、24和28 h，多糖的提取率分別為29.260%±1.570%、31.071%±1.733%、39.521%±2.219%、45.593%±1.953%和47.063%±1.518%，可見隨著沉淀時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率逐漸升高(圖6)，沉淀12 h多糖的提取率與16 h相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而沉淀12與16 h多糖的提取率與20、24和28 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；沉淀20與24和28 h相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而沉淀24 與28 h相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此選擇24 h為多糖提取的最佳沉淀時(shí)間。

圖5 沉淀溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effect of precipitation temperature on the polysaccharides extraction

圖6 沉淀時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.6 Effect of precipitation time on the polysaccharides extraction

2.7 多糖提取的正交試驗(yàn)

以95% 乙醇終濃度(體積分?jǐn)?shù))、沉淀溫度、沉淀時(shí)間為影響因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，由表2可知影響多糖提取的因素依次為沉淀時(shí)間、乙醇濃度和沉淀溫度，即A>C>B，最優(yōu)方案為A3B1C3，即3倍95% 乙醇、4 ℃ 沉淀24 h可獲得該多糖的最佳提取率。經(jīng)方差分析可知A、B、C各因素對(duì)多糖的提取均有顯著影響(P<0.05)(表3)。

表2 L9(34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of L9 (34) orthogonal test

表3 L9(34) 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Results of L9 (34) analysis of variance

2.8 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳提取條件A3B1C3進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證, 即3倍95%乙醇、4℃沉淀24 h，多糖提取率為57.835%±1.206%。

3 討論

微生物的胞外多糖由于具有產(chǎn)量大、易與菌體分離、生物活性多樣等特征而備受關(guān)注。但多糖的提取易受多種因素影響，如醇沉法的提取溫度、時(shí)間、發(fā)酵液濃縮倍數(shù)、乙醇濃度等均可影響多糖的提取率[15]。本研究采用經(jīng)典的乙醇沉淀法提取紅樹林淡紫擬青霉菌的胞外多糖，通過(guò)改變發(fā)酵液濃縮倍數(shù)、提取溫度、沉淀時(shí)間、乙醇終濃度等，觀察提取效果，以期獲得該多糖醇沉法的最佳提取條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多糖提取率隨發(fā)酵液濃縮倍數(shù)的增加而增加，發(fā)酵液濃縮4倍時(shí)糖的收率最高，達(dá)57.903%±2.742%，與原體積和濃縮1倍時(shí)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而發(fā)酵液濃縮3、4和5倍時(shí)多糖提取率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明發(fā)酵液濃縮至一定程度后再增加濃縮倍數(shù)并不能提高多糖的提取率。為探討三氯乙酸終濃度對(duì)蛋白脫除率的影響，于等體積發(fā)酵液中加入三氯乙酸至終濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%，發(fā)現(xiàn)蛋白脫除率隨三氯乙酸終濃度增加而逐漸增加，終濃度10%時(shí)蛋白脫除率最高，為80.946%±2.966%，與終濃度2%、4%、6% 時(shí)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而與終濃度 8% 時(shí)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，為盡量減少三氯乙酸對(duì)多糖提取率的影響，可選擇8%作為最佳蛋白去除濃度。

本研究還發(fā)現(xiàn)乙醇終濃度、沉淀溫度和時(shí)間均對(duì)多糖的提取率有顯著影響，4 ℃、24 h沉淀多糖時(shí)，隨著乙醇用量的增加多糖提取率亦逐漸增加，3、4和5倍體積95%乙醇對(duì)多糖的沉淀效果明顯好于1倍和2倍體積(P<0.05)，而3倍、4倍和5倍體積乙醇對(duì)多糖的沉淀無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明乙醇用量增加到一定程度之后多糖的提取率并不會(huì)隨著乙醇濃度的增加而增加；同時(shí)發(fā)現(xiàn)等體積乙醇沉淀多糖時(shí)，隨著沉淀溫度的升高，多糖的提取率逐漸降低，4和8 ℃ 的沉淀效果相似且明顯優(yōu)于16、25和37 ℃(P<0.05)，而16、25和37 ℃時(shí)多糖的沉淀效果無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明超過(guò)一定沉淀溫度之后，多糖的提取率反而會(huì)下降。另外，等體積冰乙醇4 ℃ 沉淀多糖時(shí)隨著沉淀時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率逐漸增高，沉淀28 h時(shí)多糖的提取率達(dá)47.063%±1.518%，明顯高于12、16和20 h 的多糖提取率(P<0.05)，但沉淀24與28 h相比多糖的提取率無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明達(dá)到一定的沉淀時(shí)間后多糖的提取率并不會(huì)繼續(xù)增加。

為進(jìn)一步探討乙醇濃度、沉淀時(shí)間和沉淀溫度對(duì)多糖提取的交互影響，根據(jù)此3個(gè)單因素試驗(yàn)對(duì)多糖提取的影響、提取的便利性以及多糖的質(zhì)量等多方面考慮，我們選取了部分影響較大的因素水平設(shè)計(jì)了L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響多糖提取效果的因素依次為95% 乙醇用量、沉淀時(shí)間和沉淀溫度，最優(yōu)方案為3倍95% 乙醇、4 ℃ 沉淀24 h即可獲得該多糖的最佳提取率，且經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)多糖的提取均有顯著影響(P<0.05)。因此，后續(xù)試驗(yàn)可參考本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇最優(yōu)提取方案。