CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物中的研究進(jìn)展與監(jiān)管政策

劉肖靜,王旭靜,王志興

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)(分子)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081

CRISPR-Cas9技術(shù)的原理是在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9蛋白可以對(duì)特定的雙鏈DNA進(jìn)行切割，利用細(xì)胞的天然修復(fù)機(jī)制可以發(fā)生堿基的插入、替換和缺失，從而造成移碼突變，實(shí)現(xiàn)功能基因的鑒定，獲得和培育優(yōu)良性狀的農(nóng)作物。由于該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、高效，因而成為科學(xué)研究不可或缺的工具。本文簡(jiǎn)單地回顧了CRISPR-Cas9的作用原理，詳細(xì)介紹了最新開(kāi)發(fā)的一系列CRISPR變體，歸納總結(jié)了CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用、現(xiàn)階段面臨的挑戰(zhàn)、基因編輯植物檢測(cè)方法與各國(guó)的監(jiān)管政策，以期為CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用研究及監(jiān)管研究提供參考。

1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用原理

在細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了CRISPR-Cas家族，它的主要功能是對(duì)抗外來(lái)入侵的病毒及DNA，包括CRISPR基因座和Cas基因兩部分。根據(jù)Cas的數(shù)目和功能將其分為兩個(gè)大類共6種類型(Ⅰ～Ⅵ)[1]，其中第一大類包含有Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，它們?cè)诎邢蚯懈钅繕?biāo)序列時(shí)需要多個(gè)Cas蛋白協(xié)同工作；Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型屬于第二大類，區(qū)別于第一大類，它們只需要單一的Cas蛋白就能夠靶向目標(biāo)序列。在這兩類系統(tǒng)中第二類中的Ⅱ型系統(tǒng)因其組成較為簡(jiǎn)單，僅以一個(gè)Cas9蛋白及向?qū)NA(gRNA)為核心組成，所以是目前使用最廣泛的基因編輯工具[2]，工作原理如圖1所示。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的工作原理[3]Fig.1 Natural mechanisms of CRISPR-Cas system[3]

2 新型植物基因編輯器的開(kāi)發(fā)

2.1 CRISPR-Cas12a

Cas12a也被稱為Cpf1，是與Cas9最為相似的一個(gè)系統(tǒng)。它識(shí)別的PAM序列是5′-TTTV-3′，作用原理為利用RuvC-like結(jié)構(gòu)域在crRNA引導(dǎo)下即可切割雙鏈DNA，不需tracrRNA的參與且切割后產(chǎn)生黏性末端，有利于提高基因定點(diǎn)插入的效率；與Cas9相比，Cas12a只需要一個(gè)長(zhǎng)度為42 nt的crRNA，且它的蛋白也比Cas9的蛋白更小，更加有利于多靶點(diǎn)編輯和小載體系統(tǒng)。CRISPR-Cas12a目前主要用于水稻、煙草、玉米的研究[4-7]；該系統(tǒng)和單堿基編輯器成為繼Cas9之后被廣泛應(yīng)用的新型基因編輯系統(tǒng)。

2.2 單堿基編輯器(base editing,BE)

單堿基編輯器包含胞嘧啶編輯器(cytosine BE,CBE)和腺嘌呤編輯器(adenine BE,ABE)兩種，它是指在不需要供體DNA模板或不產(chǎn)生DSB，甚至不依賴于HDR和NHEJ修復(fù)途徑的情況下，在靶位點(diǎn)上引起精確且可預(yù)測(cè)的核苷酸替換；其中CBE編輯器是由大鼠胞苷脫氨酶APOBEC1與Cas9切口酶[nCas9(D10A)]和尿嘧啶糖基酶抑制劑(UGI)融合而成的，在sgRNA的引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了胞嘧啶(C)到尿嘧啶(U)的轉(zhuǎn)換；ABE編輯器是由腺苷脫氨酶與Cas9切口酶融合而成，通過(guò)類似于CBE的作用機(jī)理實(shí)現(xiàn)了腺嘌呤(A)到鳥(niǎo)嘌呤(G)的替換[8]。

目前已在水稻、小麥、玉米、擬南芥等植物中應(yīng)用了單堿基編輯系統(tǒng),且在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系中評(píng)估了ABE和CBE的編輯效率和脫靶活性。研究表明，同一個(gè)編輯系統(tǒng)在不同靶點(diǎn)位置的編輯效率不同，CBE系統(tǒng)在靶位點(diǎn)處容易發(fā)生非特異性的插入和缺失，而在ABE編輯的植物中并未發(fā)現(xiàn)非特異性的突變。這表明CBE編輯器比ABE編輯器更加容易產(chǎn)生脫靶，研究發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象與Cas蛋白的活性及sgRNA的特異性無(wú)關(guān)，這可能是由于胞嘧啶脫氨酶的活性造成的[9]。

2.3 xCas9和Cas9-NG

xCas9和Cas9-NG兩者都是SpCas9的變體，都在一定程度上擴(kuò)展了編輯的PAM位點(diǎn)。xCas9可以識(shí)別以NG、GAA和GAT為特征的PAM位點(diǎn)，具有較高的DNA特異性和編輯效率；使用xCas9替換Cas9與胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶相融合構(gòu)建成xCas9單堿基編輯器，對(duì)于實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)編輯目的基因更是意義非凡。Cas9-NG可以識(shí)別NG、NAC、NTG、NTT和NCG的PAM位點(diǎn)，并成功用于單基因敲除、多基因敲除、單堿基編輯以及靶基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控[10-11]。

2.4 CRISPR-Cas13(C2C2)

CRISPR-Cas13與前面幾個(gè)CRISPR-Cas變體不同的是Cas13為RNA引導(dǎo)的RNA編輯器，可以特異性靶向切割病毒RNA和真核細(xì)胞中的內(nèi)源RNA。最近研究人員利用失活的Cas13將RESCUE引導(dǎo)到RNA轉(zhuǎn)錄本中的目標(biāo)胞嘧啶堿基上，實(shí)現(xiàn)了C到U的轉(zhuǎn)化[12-13]，證明了Cas13作為RNA編輯器的潛在廣闊應(yīng)用前景。

2.5 CRISPR-Cas14a

Cas14a能夠結(jié)合并切割單鏈DNA(ssDNA)，它的蛋白大小約是其他Cas蛋白的一半，且不需要識(shí)別PAM序列，是理想的抗植物ssDNA病毒的工具[14]。

2.6 引導(dǎo)編輯(prime editor，PE)

引導(dǎo)編輯是目前最新開(kāi)發(fā)的一種基因編輯方法，該方法可以在不引入雙鏈斷裂和供體DNA模板的前提下，實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的插入、替換、缺失和所有12種類型的點(diǎn)突變。它的組成包括兩部分：第一部分為pegRNA，即在我們熟知的sgRNA 3′端加上一段引物結(jié)合序列(primer binding site，PBS)和轉(zhuǎn)錄模板序列(RT template)；第二部分為引導(dǎo)編輯蛋白，由Cas9切口酶(Cas9 nickase僅有切割單鏈的功能，H840A)和逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT)兩者融合組成。它的工作原理是Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指導(dǎo)下，切割DNA單鏈識(shí)別位點(diǎn)NGG，pegRNA的引物結(jié)合序列(PBS)可以與切割位點(diǎn)前的互補(bǔ)序列識(shí)別配對(duì)，逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT)以pegRNA上的人工設(shè)計(jì)的模板序列為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而將目標(biāo)序列直接聚合到切割位點(diǎn)處的DNA鏈上。通過(guò)這個(gè)工作原理，可以在無(wú)需引入雙鏈斷裂和外源DNA供體模板的情況下，有效地產(chǎn)生精確的堿基替換、插入和缺失等突變。

最近該系統(tǒng)已經(jīng)成功運(yùn)用在植物領(lǐng)域中，但是它在植物中的編輯效率是極低和不穩(wěn)定的，因此還需要進(jìn)一步優(yōu)化植物載體元件、pegRNA設(shè)計(jì)的參數(shù)、非編輯鏈切口形成的時(shí)間和位置等[15-17]。

3 CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用

3.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物基因功能研究中的應(yīng)用

3.1.1構(gòu)建植物全基因組突變體庫(kù) 植物細(xì)胞中DSB主要是通過(guò)NHEJ途徑進(jìn)行修復(fù)，在修復(fù)的過(guò)程中出現(xiàn)小片段、大片段的缺失或者個(gè)別堿基的插入、替換等，從而發(fā)生移碼突變導(dǎo)致基因的沉默，對(duì)基因的功能進(jìn)行研究。如利用CRISPR-Cas9技術(shù)在水稻全基因組范圍內(nèi)構(gòu)建sgRNA文庫(kù)創(chuàng)制水稻突變體庫(kù)對(duì)功能基因進(jìn)行研究，該方法為植物遺傳育種提供了新的思路[18]。

3.1.2基因的定點(diǎn)插入和替換 基因的定點(diǎn)插入和替換是通過(guò)植物細(xì)胞的另一個(gè)修復(fù)途徑HDR實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)雙鏈DNA斷裂時(shí)同時(shí)引入一段供體模板，該模板序列兩端都攜帶有與斷裂處相同的堿基序列，這時(shí)細(xì)胞中有可能會(huì)發(fā)生HDR途徑即通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)供體序列的精確插入和替換；這種編輯方式有利于研究多基因控制的優(yōu)良性狀，但是由于HDR途徑在細(xì)胞中發(fā)生的概率太低，因此限制了該方式在植物上的應(yīng)用[19]。

目前提高HDR途徑的發(fā)生有以下幾種方法：①通過(guò)抑制NHEJ途徑來(lái)提高HDR介導(dǎo)的基因靶向效率；②將大量的修復(fù)模板供體DNA遞送至植物細(xì)胞核，粒子轟擊可以提供多個(gè)供體DNA拷貝。如結(jié)合雙粒病毒載體構(gòu)建CRISPR-Cas9系統(tǒng)，通過(guò)雙粒病毒載體將豐富的供體 DNA 輸送到植物細(xì)胞中，可獲得高達(dá)19.4%的靶向堿基替換或插入頻率；還有一種方法是使用RNA作為修復(fù)模板在植物中實(shí)現(xiàn)CRISPR-Cpf1介導(dǎo)的同源重組修復(fù)[20]，利用轉(zhuǎn)錄本RNA作為修復(fù)模板，借助于核酶(ribozyme)自切割和 CRISPR-Cpf1系統(tǒng)既切割DNA又切割RNA的特性，通過(guò)同源重組修復(fù)方式，實(shí)現(xiàn)了水稻乙酰乳酸合成酶(OsALS)等位基因的替換，建立了RNA轉(zhuǎn)錄本作為修復(fù)模板介導(dǎo)的DNA同源重組修復(fù)體系。除此以外，有研究報(bào)道通過(guò)在基因相鄰的兩個(gè)內(nèi)含子中分別設(shè)計(jì)一個(gè)靶位點(diǎn)，利用NHEJ途徑實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)插入和替換，這個(gè)方法的優(yōu)勢(shì)在于內(nèi)含子中雙鏈斷裂位點(diǎn)的堿基變異不會(huì)影響所在基因的功能。

新開(kāi)發(fā)的單堿基編輯器成為植物中HDR介導(dǎo)堿基精確替換和插入的替代方法[21]。由于這種方法既避免了NHEJ途徑修復(fù)的隨機(jī)性，同時(shí)也避免了HDR途徑修復(fù)的低效率性，因而目前已較為廣泛地應(yīng)用在水稻、小麥、擬南芥、玉米等植物中[22-27]。

3.2 作物優(yōu)良性狀的改良和培育

利用CRISPR-Cas系統(tǒng)可以調(diào)控基因的表達(dá)，從而獲得高產(chǎn)、抗病、抗逆等農(nóng)作物的優(yōu)良品質(zhì)。第一種思路是研究者通過(guò)對(duì)靶基因的啟動(dòng)子活性區(qū)域進(jìn)行編輯，既而改變基因的表達(dá)水平與調(diào)控模式。例如破壞水稻OsSWEET14啟動(dòng)子中的細(xì)菌衍生蛋白結(jié)合序列導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌枯萎病的抗性增加；靶向修飾宿主疾病易感基因CsLOB1啟動(dòng)子獲得了抗?jié)兏涕倨贩N[28-29]；編輯內(nèi)源基因EPSPS和ALS產(chǎn)生了抗除草劑的水稻；對(duì)番茄中多個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)順式調(diào)控元件(CRE)的編輯實(shí)現(xiàn)了果實(shí)大小等重要農(nóng)藝性狀的精準(zhǔn)調(diào)控[30]。第二種思路為通過(guò)dCas9和特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成融合蛋白，從而調(diào)控基因的表達(dá)。dCas9是Cas9蛋白的一種突變體，即Cas9蛋白的RuvC1和HNA兩個(gè)核酸酶活性結(jié)構(gòu)域同時(shí)發(fā)生突變失活，dCas9蛋白失去了內(nèi)切酶活性，只保留由sgRNA引導(dǎo)進(jìn)入基因組的能力，這種方法已經(jīng)在水稻、煙草和擬南芥中得到應(yīng)用[31-32]。還有一種思路即基因編輯與表觀遺傳修飾的結(jié)合，利用dCas9融合各種表觀調(diào)控效應(yīng)器，由sgRNA引導(dǎo)進(jìn)入目標(biāo)基因組位點(diǎn)進(jìn)行特異性的表觀調(diào)控。如dCas9融合轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄原件，通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄因子或修飾因子起到調(diào)控作用[33-38]；或者dCas9和表觀遺傳修飾酶形成融合蛋白，可以高效地催化DNA和組蛋白的表觀修飾，達(dá)到了基因的表達(dá)調(diào)控，目前這種思路在植物中報(bào)道很少。

值得注意的是，單堿基編輯器也是利用了缺陷型的Cas9蛋白，但使用單堿基編輯器只產(chǎn)生nick而不產(chǎn)生DSB的nCas9，且它融合的是堿基編輯蛋白胞苷脫氨酶和腺苷脫氨酶；CRISPR介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控則是使用完全失去內(nèi)切酶活性的dCas9，它融合的是激活因子和抑制因子等。

同時(shí)設(shè)計(jì)多個(gè)不同的sgRNA分別靶向多個(gè)基因或者在保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)一個(gè)sgRNA靶向多個(gè)同源基因，這種多靶點(diǎn)編輯方法適用于功能冗余基因和基因家族的研究；例如同時(shí)敲除水稻GW2、GW5和TGW6基因，明顯提高了水稻的籽粒重量[39]；對(duì)六倍體普通小麥TaMLO基因的3個(gè)同源等位基因同時(shí)進(jìn)行敲除獲得了廣譜抗白粉病小麥新品種[40]。

4 CRISPR-Cas系統(tǒng)的局限性

盡管CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種強(qiáng)大的基因編輯工具，但依然存在很多局限。如：編輯效率的高低、脫靶問(wèn)題和未知的非預(yù)期效應(yīng)、PAM識(shí)別位點(diǎn)的限制、同源重組途徑效率低下，以及不同植物的轉(zhuǎn)化問(wèn)題等。

脫靶效應(yīng)是指在基因編輯過(guò)程中，當(dāng)sgRNA序列識(shí)別出特定序列之外的部分錯(cuò)配而不是靶位點(diǎn)時(shí)，就會(huì)發(fā)生非特異性切割從而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。脫靶可以導(dǎo)致染色體重排，干擾染色體的穩(wěn)定性發(fā)生未知的非預(yù)期效應(yīng)；還可能導(dǎo)致非靶基因功能活性的喪失，從而導(dǎo)致各種生理或信號(hào)異常，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。在植物中，CRISPR-Cas系統(tǒng)已在超過(guò)30種植物和數(shù)百個(gè)基因中實(shí)現(xiàn)成功編輯[41]，脫靶現(xiàn)象的出現(xiàn)對(duì)于基因編輯技術(shù)的應(yīng)用帶來(lái)了很大的不確定性。因此非常有必要對(duì)基因組編輯中存在的脫靶問(wèn)題進(jìn)行系統(tǒng)分析，進(jìn)一步提高基因編輯的特異性。

研究表明脫靶情況的出現(xiàn)與靶序列的特異性有關(guān)[42～43]。目前，提高基因編輯特異性的方法有三種，第一種方法是提供兩個(gè)Cas9蛋白，例如兩個(gè)DNA單鏈可以被一對(duì)Cas9切口酶[nCas9(D10A)]切割。但該方法在編輯位點(diǎn)的選擇上存在局限性，且重組載體中含有兩個(gè)Cas蛋白降低了植物轉(zhuǎn)化的效率。第二種方法是優(yōu)化改造更多的Cas蛋白變體，如前面所列舉的單堿基編輯器(BE)、xCas9等系列Cas蛋白變體，它們擴(kuò)展了PAM序列的識(shí)別位點(diǎn)，擴(kuò)大了基因組的編輯范圍，提高了編輯效率。第三種方法是直接截短sgRNA的長(zhǎng)度或者改造sgRNA的結(jié)構(gòu),已有實(shí)驗(yàn)證明截短sgRNA長(zhǎng)度可以降低脫靶活性，但是相應(yīng)的編輯效率也會(huì)降低[44-51]；研究者通過(guò)改造sgRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在它的5’末端延伸出1個(gè)hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hp-sgRNA)將該結(jié)構(gòu)引入到間隔序列(the spacer)上，阻礙脫靶位點(diǎn)R-loop的形成，可有效抑制Cas9在脫靶位點(diǎn)的活性，從而實(shí)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)特異性的提高。除此以外，可以利用全基因組測(cè)序(WGS)的方法檢測(cè)脫靶情況，目前已經(jīng)在水稻和棉花中進(jìn)行了報(bào)道，證實(shí)有個(gè)別脫靶情況的存在。同時(shí)研究人員開(kāi)發(fā)了一系列的脫靶預(yù)測(cè)工具分析脫靶情況，如：CRISPR-P和CRISPR-GE等，設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)應(yīng)該選擇靶點(diǎn)得分高的進(jìn)行編輯，并在獲得編輯的植株后對(duì)其潛在預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析。

5 基因編輯植物的檢測(cè)方法與監(jiān)管政策

5.1 基因編輯植物的檢測(cè)方法

利用CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物中進(jìn)行基因編輯后，獲得的植株將產(chǎn)生不同的突變。目前基因編輯位點(diǎn)檢測(cè)方法最常用的有3種：Sanger測(cè)序的靶點(diǎn)檢測(cè)方法、T7E1(T7 endonuclease I)法和高通量二代測(cè)序NGS(next generation sequencing)。

5.1.1Sanger測(cè)序的靶點(diǎn)檢測(cè)方法 該方法通過(guò)特異性引物擴(kuò)增編輯位點(diǎn)序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示正常的通過(guò)與野生型靶序列比對(duì)得到基因純合突變類型的植株，如果測(cè)序結(jié)果顯示雙峰，首先觀察雙峰位點(diǎn)是否從切割位點(diǎn)附近開(kāi)始，然后構(gòu)建克隆T載體，并挑取多個(gè)克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序，從而獲得多種突變類型的植株；這種方法雖然簡(jiǎn)便但是只適合少量基因編輯植株的檢測(cè)，耗時(shí)長(zhǎng)花費(fèi)也比較高。

5.1.2T7E1法 該方法是通過(guò)特異切割錯(cuò)配分子從而檢測(cè)突變情況，它可以識(shí)別和裂解不匹配的異雙鏈DNA，可以檢測(cè)到長(zhǎng)達(dá)12 nt的插入和缺失[52]，被認(rèn)為適用于任何目標(biāo)序列，但是它的檢測(cè)靈敏度較低。

5.1.3高通量二代測(cè)序NGS 利用該技術(shù)可以對(duì)編輯的植株進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得該植株所有的基因序列信息；目前在分析CRISPR-Cas系統(tǒng)的脫靶情況都是采用這種方法，通過(guò)全基因組測(cè)序分別檢測(cè)編輯植株、經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的野生型植株和野生型植株的基因序列信息，比較獲得的SNP、Indel、SNV，從而評(píng)估它的編輯和脫靶情況[9]。

5.2 基因編輯作物安全監(jiān)管政策

CRISPR-Cas系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)，且用途和適用性廣泛，在市場(chǎng)商業(yè)化方面有廣闊的應(yīng)用前景。由于操作簡(jiǎn)單、沒(méi)有外源DNA序列的插入，在監(jiān)管方面就基因編輯是否以轉(zhuǎn)基因態(tài)度來(lái)對(duì)待，我國(guó)尚未出臺(tái)任何相關(guān)規(guī)定[39-41]；目前不同國(guó)家和地區(qū)對(duì)它的監(jiān)管持不同態(tài)度，還沒(méi)有形成統(tǒng)一的規(guī)定。

5.2.1美國(guó)對(duì)基因編輯的監(jiān)管政策 2018年3月28日，美國(guó)農(nóng)業(yè)部已經(jīng)出臺(tái)政策指出對(duì)基因編輯產(chǎn)品不會(huì)進(jìn)行監(jiān)管。2020年6月，美國(guó)農(nóng)業(yè)部給出了支持性的指南，可通過(guò)監(jiān)管獲免和未來(lái)獲免決定監(jiān)管狀況程序來(lái)監(jiān)管基因編輯產(chǎn)品。監(jiān)管獲免是指，植物性狀與通過(guò)傳統(tǒng)育種性狀一樣或者植物性狀已經(jīng)獲得農(nóng)業(yè)部的審批的，不用上市前審批。獲得監(jiān)管獲免的植物品種包括3種類型：?jiǎn)螇A基的刪除、單堿基對(duì)的替換、來(lái)源于有性親和的近緣植物的插入——對(duì)植物的改變僅包括從有性親和的近緣植物引入。如果產(chǎn)品沒(méi)有獲得獲免，可以寫(xiě)信給APHIS上訴請(qǐng)求審批，如果通過(guò)可獲得獲免，不需要上市前審批，這就是未來(lái)獲免。后續(xù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部會(huì)逐步實(shí)施審批指南，以草案形式發(fā)布，征求意見(jiàn)[56-58]。

5.2.2日本對(duì)基因編輯的監(jiān)管政策 日本處于一個(gè)不歡迎轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的大環(huán)境下，日本對(duì)基因編輯這種新技術(shù)保持謹(jǐn)慎的態(tài)度?；蚓庉嫳O(jiān)管的核心問(wèn)題是基因編輯產(chǎn)品有沒(méi)有核酸模板的插入，是否會(huì)產(chǎn)生除自然或性親和細(xì)胞外的核酸，如果這些插入的DNA來(lái)源于自然狀態(tài)下或者性親和即為非轉(zhuǎn)基因，反之，最終產(chǎn)品中是否體現(xiàn)該核酸，如沒(méi)有體現(xiàn)則為非轉(zhuǎn)基因，層層分析，個(gè)案分析。

5.2.3澳大利亞對(duì)基因編輯的監(jiān)管政策 澳大利亞基因編輯監(jiān)管的核心問(wèn)題也在于基因編輯產(chǎn)品有沒(méi)有核酸模板的插入，目前已經(jīng)落實(shí)的審議結(jié)果是：確定了幾種定點(diǎn)核酸技術(shù),SDN1屬于自然修復(fù)沒(méi)有核酸模板的插入，屬于非轉(zhuǎn)基因；SDN2和ODM有核酸模板的提供，利用同源重組進(jìn)行修復(fù)；SDN3定點(diǎn)插入了一個(gè)長(zhǎng)片段，有核酸模板的插入；SDN2和SDN3以轉(zhuǎn)基因態(tài)度來(lái)對(duì)待。

5.2.4歐盟對(duì)基因編輯的監(jiān)管政策 歐盟對(duì)于轉(zhuǎn)基因有很清晰的定義與立法。歐盟基因編輯監(jiān)管的關(guān)鍵問(wèn)題在于是否以轉(zhuǎn)基因的態(tài)度來(lái)對(duì)待基因編輯產(chǎn)品。2018年7月歐洲法院進(jìn)行了法律解釋，即通過(guò)誘變獲得的生物體屬于轉(zhuǎn)基因生物，并且在原則上受到轉(zhuǎn)基因生物法規(guī)所規(guī)定義務(wù)的約束。然而，對(duì)于常規(guī)在多種應(yīng)用上使用、且有長(zhǎng)期的安全記錄的誘變技術(shù)，通過(guò)其獲得的生物體可以免除相關(guān)的義務(wù)，成員國(guó)可與歐盟法規(guī)一致，無(wú)須遵守指令所規(guī)定的義務(wù)或其他義務(wù)[59-61]。

6 展望

CRISPR-Cas系統(tǒng)因其操作簡(jiǎn)單、高效、成本相對(duì)較低，因而成為植物分子生物學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，也是近幾年植物中研究的熱點(diǎn)方向?；蚓庉嫾夹g(shù)在作物遺傳育種、優(yōu)良性狀改良、功能基因研究中都顯現(xiàn)了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，雖然現(xiàn)在開(kāi)發(fā)出了很多新型的CRISPR-Cas變體，進(jìn)一步提高了基因編輯的特異性和高效性，擴(kuò)展了PAM序列的識(shí)別位點(diǎn)，提高了同源重組修復(fù)途徑的編輯效率，優(yōu)化了植物組培技術(shù)，但是脫靶情況仍然不能完全避免，這對(duì)于科學(xué)研究始終是一個(gè)不確定的未知因素，因此在應(yīng)用基因編輯技術(shù)的時(shí)候必須考慮分析潛在的脫靶位點(diǎn)，研發(fā)編輯范圍廣、特異性高的CRISPR系統(tǒng)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和優(yōu)化編輯位點(diǎn)檢測(cè)方法仍然是科研工作者面臨的重大挑戰(zhàn)和今后突破的方向。