中晚期結(jié)直腸癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的臨床意義

胡招兵，賈志紅，王仁杰，吳穎虹，祝淇瀅

景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院1腫瘤科，2病理科，江西 景德鎮(zhèn) 333000

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，確診時(shí)多屬中晚期，導(dǎo)致治療效果和預(yù)后不佳。目前臨床常用的檢查手段有影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)志物、腸鏡、病理活檢等，然而受限于射線損害、有創(chuàng)性或特異度不高且僅能發(fā)現(xiàn)肉眼可見的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)血液中的微小轉(zhuǎn)移灶等因素，導(dǎo)致對(duì)于更早期的病變無效。因此，如何有效監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展并準(zhǔn)確判斷預(yù)后一直是結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。為了解決這些缺陷，以便更全面評(píng)估預(yù)后以及改善患者生活質(zhì)量，需要找到更加敏感、有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。液體活檢技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，主要包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌體（exosome）、微小RNA（microRNA，miRNA）等技術(shù)應(yīng)用于血液、漿膜腔積液等檢測(cè)[1]。伴隨分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，促使CTC的高效檢測(cè)成為可能。本研究探討中晚期結(jié)直腸癌外周血CTC計(jì)數(shù)變化，以期為該類患者的治療及預(yù)后評(píng)估提供重要的參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年6月景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理確診為結(jié)直腸癌；臨床分期為Ⅱ～Ⅳ期；美國東部腫瘤協(xié)助組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評(píng)分≤2分；生存時(shí)間＞4周；首次采集CTC時(shí)患者未行任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：未明確診斷或合并其他類型的惡性腫瘤；有嚴(yán)重心肺疾病、自身免疫性疾病、血液病、長期口服抗凝藥或合并嚴(yán)重感染無法接受抗腫瘤治療；臨床資料信息不完整。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入結(jié)直腸癌患者36例，其中男性21例，女性15例；年齡 45～89歲，平均（69.83±8.16）歲；臨床分期：Ⅱ期10例，Ⅲ期18例，Ⅳ期8例。選取同期收治的22例腸道良性病變患者為對(duì)照，其中男13例，女 9例；年齡 38～86歲，平均（61.72±7.09）歲；慢性炎癥12例，潰瘍性結(jié)腸炎3例，炎性息肉4例，克羅恩病3例。結(jié)直腸癌患者和腸道良性病變患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 化療方法 結(jié)直腸癌患者接受常規(guī)化療奧沙利鉑+卡培他濱（XELOX）方案，第1天予以130 mg/m2奧沙利鉑靜脈滴注，第1～14天1000 mg/m2卡培他濱片口服，每3周重復(fù)一次。化療第2周期結(jié)束后進(jìn)行CTC檢測(cè)。

1.2.2 CTC檢測(cè)方法 取肘正中靜脈血4 ml于ACD抗凝劑真空采血管，采血后立即輕柔顛倒混勻防止出現(xiàn)溶血或血塊。將血全部移至50 ml離心管中，滴入工作液CS1至45 ml離心（1900 r/min，5min），棄上清滴CS2至45ml于垂直混勻儀（20r/min，8～10 min）。吸取 150 μl磁微粒混懸液至 2 ml EP管中，置于磁力架上1 min后棄上清，滴加1 ml CS1重復(fù)洗滌3次，用CS1重懸磁微粒定容100 μl。50 ml離心管中滴加3 ml CS3，將加入磁微粒中的所有液體輕輕疊加到CS3頂層，離心（1400 r/min，5 min）。輕柔吸取最上2層溶液于15 ml離心管中，滴CS1至14 ml，混勻離心（2300 r/min，室溫，5 min），棄上清，滴1 ml CS1，吹打細(xì)胞沉淀，置于磁力架上2～3 min，離心（3400 r/min，3 min），棄上清至 100 μl，加入100 μl CF1固定液，吹打混勻≥10次，涂片，取1×CF2固定液200～300 μl完全覆蓋標(biāo)本區(qū)域，室溫8 min后吸去CF2，核酸雜交漂洗液中靜置10 min，梯度酒精脫水各2 min，晾干待用。避光吸取10 μl 8號(hào)/7號(hào)染色體著絲粒探針（centromeric probe，CEP），封住蓋玻片邊緣。原位雜交儀變性（76℃5 min）、雜交（37℃1.5 h），清洗，滴加 200 μl抗體，孵育（37℃ 1 h），10 μl 4，6-二脒基苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染，鏡下觀察或置于2～8℃避光保存。

1.3 CTC判讀標(biāo)準(zhǔn)

①單個(gè)細(xì)胞，核質(zhì)均勻，未發(fā)現(xiàn)分層；②信號(hào)3個(gè)，且在胞核上；③紅色通道下CD45不顯色；④細(xì)胞表面無磁珠。經(jīng)過鑒定符合上述標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞，可認(rèn)為是上皮組織來源的腫瘤細(xì)胞，即CTC。本研究將滿足CEP8+/CD45-/DAPI+或CEP7+/CD45-/DAPI+的細(xì)胞視為陽性細(xì)胞，CEP8/CEP7陽性≥2時(shí)，判讀為CTC陽性[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC陽性率的比較

結(jié)直腸癌患者CTC陽性率為63.89%（23/36），高于腸道良性病變患者的0%（0/22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者CTC陽性率的比較

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的CTC陽性率分別高于TNM分期為Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、性別及是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的CTC陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者CTC陽性率的比較（ n=36）

2.3 化療前后CTC陽性率的比較

化療后結(jié)直腸癌患者CTC陽性率為22.22%（8/36），明顯低于化療前的63.89%（23/36），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.251，P＜0.01）。

3 討論

惡性腫瘤已然成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一，其中結(jié)直腸癌躍升為世界第三大惡性腫瘤[3]。中國結(jié)直腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第三位，病死率居第五位[4-5]，并呈逐年上升趨勢(shì)。伴隨手術(shù)、放化療等綜合手段的應(yīng)用，結(jié)直腸癌患者5年和10年生存率達(dá)到65%與58%，但仍有半數(shù)左右的患者在腫瘤進(jìn)展過程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡[6]。

CTC指由原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)后大多數(shù)被消滅，只有極少數(shù)以單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞簇形式存活的腫瘤細(xì)胞，并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。健康人血液中也存在極少量的CTC（≤1個(gè)），而在腫瘤尤其伴有轉(zhuǎn)移患者中其表達(dá)水平顯著升高[7-8]。2010年美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）首次把CTC納入腫瘤TNM分期系統(tǒng)后[9]，有研究證實(shí)CTC數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，陽性患者CTC數(shù)量明顯多于陰性患者[10]。目前CTC已在肺癌[11]、頭頸部惡性腫瘤[12]、食管癌[13]、胃癌[114]等腫瘤的診治過程中獲得較高的臨床價(jià)值。本研究中腸道良性病變患者均未檢出CTC，說明本次研究采用的陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交技術(shù)（immunofluorescence-fluorescence in situ hybridization，im-FISH）檢測(cè)方法的特異度較高。結(jié)直腸癌患者CTC陽性率為63.89%，這與Wang等[18]和茍苗苗等[19]的研究結(jié)果趨于一致。本研究發(fā)現(xiàn)CTC陽性主要集中在TNM分期中的Ⅲ～Ⅳ期患者，占76.92%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者占76.00%，且分期越高、CTC計(jì)數(shù)有升高趨勢(shì)，說明CTC有助于評(píng)估腫瘤患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而評(píng)價(jià)預(yù)后。

2018年AJCC將CTC納入乳腺癌的預(yù)后評(píng)估，認(rèn)為乳腺癌患者外周血中存在CTC提示預(yù)后不良[15]。同期一項(xiàng)關(guān)于早期乳腺癌患者的大樣本、多中心臨床試驗(yàn)研究表明化療后CTC的存在是總生存期和無進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，且CTC計(jì)數(shù)越多，危險(xiǎn)度越高，預(yù)后越差[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)化療后CTC陰性結(jié)直腸癌患者28例，提示這部分患者在化療過程中，CTC被化療藥物在一定程度上有效清除，說明化療方案有效果。李柔等[20]動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)卵巢癌化療前后CTC水平發(fā)現(xiàn)，依據(jù)CTC計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)療效與實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）之間的吻合度較高，且CTC表達(dá)水平與化療療效呈負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果也有相似的趨勢(shì)。因此，有理由相信CTC檢測(cè)可作為評(píng)估結(jié)直腸癌療效的有效指標(biāo)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其變化可評(píng)價(jià)療效及預(yù)后，實(shí)現(xiàn)真正的個(gè)體化治療，提高患者生存獲益。對(duì)于CTC尚未轉(zhuǎn)陰的患者是否繼續(xù)治療除與患者的經(jīng)濟(jì)狀況、身體耐受情況等因素有關(guān)外，是否把CTC陽性作為繼續(xù)治療的依據(jù)尚存在一定爭議，還需要大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。不過有學(xué)者認(rèn)為CTC持續(xù)陽性是接受化療的晚期結(jié)直腸癌患者無進(jìn)展生存期和總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[21]。

近年來，靶向治療、免疫治療已然成為腫瘤治療的熱點(diǎn)。CTC作為術(shù)后腫瘤標(biāo)本的唯一來源，不僅能完整表達(dá)腫瘤組織的生物學(xué)特性，且樣本容易獲取。伴隨對(duì)CTC基因表型的分析，體外細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)以及對(duì)腫瘤的耐藥/治療靶點(diǎn)的不斷深入研究，CTC作為靶向治療位點(diǎn)將變?yōu)榭赡躘22]。由于本研究時(shí)間較短、樣本量偏少，對(duì)于CTC與臨床療效、預(yù)后等信息的關(guān)聯(lián)性還有待下一步的研究。