雞樹突狀細(xì)胞的間接免疫熒光制片方法比較

何靜怡，舒鼎銘，林楚曉，李 瑩，王 艷，羅成龍

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部家禽遺傳育種重點實驗室/廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】樹突狀細(xì)胞因其成熟細(xì)胞具有樹突狀或偽足樣的突起而被命名[1]。作為最重要抗原呈遞細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)啟動特異性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，其免疫熒光定位和功能研究一直是國內(nèi)外細(xì)胞免疫學(xué)研究的熱點之一。近幾年，免疫熒光技術(shù)和激光共聚焦掃描顯微鏡（laser scanning confocal microscopy, LSCM）分別被廣泛應(yīng)用，學(xué)者們找到研究樹突狀細(xì)胞的技術(shù)突破。免疫熒光技術(shù)是目前綜合細(xì)胞形態(tài)、熒光定量、蛋白定位、免疫功能等研究的最強(qiáng)檢測工具，通過觀察蛋白上激發(fā)特異性標(biāo)記的熒光，可直觀顯示其在細(xì)胞中的位置，有助于揭示病原在抗原定位和蛋白質(zhì)功能等方面的特征[2]。激光掃描共聚焦顯微鏡作為近代生物醫(yī)學(xué)圖像分析儀器的重要發(fā)展之一，是目前應(yīng)用最廣泛和光學(xué)圖像分辨率最高的分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器[3]，僅檢測反射自焦平面的光線部分，大大提高了圖像的分辨率和對比度，使細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)更精準(zhǔn)。兩者聯(lián)合既進(jìn)一步提高研究樹突狀細(xì)胞生物學(xué)的實驗技術(shù)和方法，又為細(xì)胞生物學(xué)研究提供更廣闊的前景。

【前人研究進(jìn)展】細(xì)胞爬片是根據(jù)細(xì)胞對玻璃或塑料的黏附力特點建立的，是觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)最常用的一種試驗手段，一般把細(xì)胞接種在裝有蓋玻片的孔板中，待在玻片上貼壁生長后再進(jìn)行后續(xù)的普通染色或免疫試驗。已有學(xué)者利用細(xì)胞爬片進(jìn)行體外試驗，對細(xì)胞進(jìn)行各種干預(yù)處理，被應(yīng)用于觀察細(xì)胞形態(tài)和蛋白分布情況[4-5]。而細(xì)胞滴片是細(xì)胞懸液離心滴片經(jīng)甲醛固定所成，大多應(yīng)用于觀察胞內(nèi)不同時期蛋白表達(dá)變化的一種試驗手段，如常用的血涂片、動物口腔或腹腔洗液滴片[6]等。國內(nèi)對于兩種制片方法的對比研究最早在1979年張?zhí)N芬等[7]觀察巨噬細(xì)胞吞噬功能的方法比較試驗中。近年制片方法的對比研究在不斷創(chuàng)新和進(jìn)步，如李紅軍等[8]從免疫組化的角度對比分析貼壁細(xì)胞不同制片方法。

【本研究切入點】目前實驗標(biāo)本大多為組織切片[9-10]、活細(xì)胞培養(yǎng)瓶皿，而本研究針對細(xì)胞進(jìn)行制片。懸浮細(xì)胞一般常用細(xì)胞滴片，貼壁細(xì)胞則用細(xì)胞爬片[11-13]，而樹突狀細(xì)胞是一種介于懸浮和貼壁狀態(tài)的半懸浮細(xì)胞。普通光學(xué)制片無法保持樹突狀細(xì)胞的形態(tài)和特點，而且LSCM較少應(yīng)用于樹突狀細(xì)胞的動態(tài)蛋白標(biāo)記研究中，也很少學(xué)者深入探討更能準(zhǔn)確有效地提高實驗效率的制片方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以雞胚為素材，經(jīng)原代分離定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)獲得骨髓源雞樹突狀細(xì)胞，分別制作細(xì)胞爬片和細(xì)胞滴片，選取具體表性的內(nèi)源性蛋白ROBO2（Roundabout）和外源性蛋白NDV（newcastle disease virus），利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和LSCM檢測分析技術(shù)，多方位對比分析兩種制片方法，為后續(xù)深入解析雞胚細(xì)胞中免疫熒光定位以及蛋白功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30枚雞胚（19日胚齡），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所提供。

主要試劑：chicken GM-CSF和chicken IL-4（KINGFISHER BIOTECH，美國），澳洲血源胎牛血清（FBS）、RPMI1640、胰酶和青鏈霉素抗生素（GIBCO，美國），4%多聚甲醛、TritonX-100、胎牛血清蛋白（上海生物工程股份有限公司），抗熒光淬滅封片液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。新城疫病毒lasota株（廣東永順生物制藥股份有限公司），小鼠抗人ROBO2單克隆抗體（08253-4G5）（SIGMA-ALORICH），雞源NDV單克隆抗體（北京天之泰生物科技有限公司），羊抗小鼠IgGⅡ抗926-68070（LI-COR，美國），羊抗雞IgYⅡ抗SA5-10070（THERMO，美國），DAPI染液（ROCHE，瑞士）。

主要儀器和耗材：倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本），LSM7100激光共聚焦掃描顯微鏡（CARL-ZEISS，德國），無菌直徑14 mm細(xì)胞玻片（上海臥宏生物公司），免疫熒光筆（CIRISC，日本），細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材（THERMO，美國）。

1.2 試驗方法

種蛋孵化及試驗操作均在畜禽育種國家重點實驗室內(nèi)進(jìn)行，孵化溫度37（±0.5）℃，濕度45（±1）%。所有操作符合動物科學(xué)實驗倫理要求。

1.2.1 雞胚骨髓源細(xì)胞原代分離 取出30枚胚蛋，分離雞胚脛骨、股骨，沖洗骨髓，收集組織液，1 000 r/min離心5 min；用含GM-CSF和IL-4 的10%FBS RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸沉淀。

1.2.2 雞樹突狀細(xì)胞滴片制作 將細(xì)胞懸液接種到24孔板中，于39 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)6 d后，胰酶消化，收集原代雞骨髓源樹突狀細(xì)胞，以5×105個/mL分裝4管，100MOI NDV接毒15 min，設(shè)陰性對照，3個重復(fù)，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用免疫熒光筆在24孔圓形玻片邊沿畫密封圈，面朝上放入24孔板。細(xì)胞懸液滴入蓋玻片圈內(nèi)，靜置10 min，使其粘附完成制片。

1.2.3 雞樹突狀細(xì)胞爬片制作 將細(xì)胞懸液接種到24孔板圓形玻片，讓其在玻片表面貼壁生長，于39 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分化6 d后將原代雞骨髓源樹突狀細(xì)胞分成3組，每組設(shè)3孔100MOI NDV（接毒15 min）、1孔陰性對照。PBS洗板3次完成制片。

1.2.4 兩種方法制片效果的比較 利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和LSCM檢測對比分析兩種制片方法。

（1）免疫熒光試驗程序：用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次；再經(jīng)預(yù)冷的0.2%TritonX-100透化10 min，PBS漂洗3次；加入現(xiàn)配的5%BSA室溫封閉1 h。

（2）雙抗體孵育：取10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿依次放入標(biāo)記紙、封口膜、抗體24孔玻片，制作孵育板。雞源NDV抗體與ROBO2抗體按1∶2混合配制，小鼠源ROBO2單克隆抗體稀釋度為1∶50，雞源NDV抗體稀釋度為1∶25，混合抗體，將細(xì)胞面與抗體充分接觸，4 ℃ 孵育過夜；PBS漂洗3次；羊抗小鼠Ⅱ抗標(biāo)記ROBO2、羊抗雞Ⅱ抗標(biāo)記NDV，稀釋度為1∶200。小鼠Ⅱ抗和雞Ⅱ抗以1∶1混合避光室溫放置1 h；避光清洗3次；DAPI（1 μg/mL）染液室溫下避光標(biāo)記細(xì)胞核5 min，PBS漂洗3次；將抗熒光淬滅封片液（3 μL/片）滴至載玻片，取滴片/爬片倒扣封片，4 ℃避光保存，24 h內(nèi)觀察。

（3）激光共聚焦掃描法：以波長340、488、680 nm激發(fā)檢測，NDV、ROBO2、DAPI依次顯示為綠光、紅光、藍(lán)光。用63倍油浸物鏡（數(shù)值孔徑1.25）觀察兩種類型玻片，用LSM7100 ZEN2010軟件捕捉和分析圖像數(shù)據(jù)后進(jìn)行對比分析。

（4）免疫熒光定量分析：根據(jù)捕捉的圖像數(shù)據(jù)，按照抗體免疫熒光強(qiáng)度和顯色特點，將免疫反應(yīng)性分級為單陽性、陰性，以及兩抗體熒光疊加時的雙陽性。用Excel統(tǒng)計每個視野下各指標(biāo)的百分比，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件處理，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟雞樹突狀細(xì)胞

根據(jù)雞樹突狀細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[14]，對培養(yǎng)獲得的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。如圖1所示，原代分離的細(xì)胞經(jīng)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種NDV后所得細(xì)胞體積增大，伸出呈樹突狀的突起或偽足，說明獲得了成熟的樹突狀細(xì)胞。

圖1 樹突狀細(xì)胞顯微鏡檢結(jié)果 （×10 ）Fig. 1 Microscopy of dendritic cells （×10）

2.2 兩種玻片ROBO2抗體共聚焦掃描結(jié)果比較

通過熒光標(biāo)記ROBO2，統(tǒng)計免疫反應(yīng)分級百分比，對滴片法與爬片法的抗體免疫反應(yīng)性進(jìn)行定量差異性分析，結(jié)果（圖2）顯示，滴片法與爬片法的ROBO2單陽性率分別為93.73%和0.00%，陰性率分別為4.97%和72.22%，均存在極顯著差異。

圖2 ROBO2免疫反應(yīng)性結(jié)果Fig. 2 Immunoreactivity result of ROBO2

雙抗體共孵育時，滴片法的ROBO2單陽性率比爬片法高，而陰性率爬片法較高，比較發(fā)現(xiàn)滴片法樹突狀細(xì)胞的ROBO2顯色性更強(qiáng)。根據(jù)激光共聚焦掃描結(jié)果（圖3），對比兩種制片法已標(biāo)記的ROBO2，均有明亮的紅色熒光。說明滴片法比爬片法更有利于ROBO2抗體標(biāo)記。

圖3 ROBO2激光共聚焦顯微鏡檢結(jié)果（×63）Fig. 3 LSCM result of ROBO2（×63）

2.3 兩種玻片NDV抗體共聚焦掃描結(jié)果比較

通過熒光標(biāo)記NDV，統(tǒng)計免疫反應(yīng)分級百分比，對滴片法與爬片法的抗體免疫反應(yīng)性進(jìn)行差異性分析，結(jié)果（圖4）顯示，滴片法與爬片法的NDV單陽性率分別為61.50%和1.51%，陰性率分別為32.60%和70.70%，均存在顯著差異。

圖4 NDV免疫反應(yīng)性結(jié)果Fig. 4 Immunoreactivity result of NDV

雙抗體共孵育時，滴片法的NDV單陽性率比爬片法高，而陰性率爬片法略高，比較發(fā)現(xiàn)滴片法樹突狀細(xì)胞的NDV顯色性更強(qiáng)。根據(jù)激光共聚焦掃描結(jié)果（圖5），對比兩種制片法已標(biāo)記的NDV，均有明亮的綠色熒光。說明滴片法比爬片法更有利于NDV抗體標(biāo)記。

圖5 NDV激光共聚焦顯微鏡檢結(jié)果（×63 ）Fig. 5 LSCM result of NDV （×63）

2.4 兩種玻片雙抗體共聚焦掃描結(jié)果比較

從熒光反應(yīng)性差異性分析結(jié)果（圖2和圖4）可知，滴片法與爬片法雙陽性率分別為0.46%和27.78%，差異顯著。爬片法雙陽性率比滴片法高，說明爬片法利于雙抗體的孵育。如圖6所示，滴片顯示出ROBO2和NDV相對應(yīng)的紅色和綠色熒光，而爬片兩蛋白顯色重疊，顯示出明亮的黃色熒光。

圖6 雙抗體激光共聚焦顯微鏡檢結(jié)果（×63）Fig. 6 LSCM result of two antibodies （×63）

3 討論

目前，細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用廣泛，而免疫組織化學(xué)是顯示抗原定位的良好手段，兩種技術(shù)結(jié)合為醫(yī)藥衛(wèi)生研究[15]以及畜禽病致病機(jī)理研究提供了有效的研究手段。制作良好的熒光玻片，各個環(huán)節(jié)都非常重要。細(xì)胞滴片制作過程，細(xì)胞消化和計數(shù)等繁瑣且耗時長；細(xì)胞爬片制作則直接接種于玻片上，無需消化，操作簡單，始終保持細(xì)胞原有的細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)，這對細(xì)胞蛋白定位的研究尤為重要。此外，細(xì)胞滴片是細(xì)胞粘附玻片，其附著力不及直接貼壁生長的爬片細(xì)胞，間接免疫熒光程序的加樣和清洗玻片，導(dǎo)致細(xì)胞碎片和細(xì)胞數(shù)目損耗增多。本研究稍改進(jìn)試驗方法，使樹突狀細(xì)胞更高效地標(biāo)記上抗體，滴片孵育試劑直接滴入所畫免疫圈內(nèi)，使玻片細(xì)胞面充分接觸試劑；細(xì)胞爬片需制作簡易孵育膜倒扣孵育，要求技術(shù)操作熟練，以減少玻片破碎的可能。

本試驗探索制片方法對蛋白免疫熒光顯示的影響，為樹突狀細(xì)胞蛋白研究提供標(biāo)本制作的選擇依據(jù)。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞滴片和細(xì)胞爬片的NDV和ROBO2單陽性率及陰性率分別存在極顯著差異；對于單一蛋白，細(xì)胞滴片免疫反應(yīng)性優(yōu)于細(xì)胞爬片；兩種制片法雙陽性存在熒光反應(yīng)性差異顯著。結(jié)合激光共聚焦掃描結(jié)果分析，細(xì)胞滴片樹突狀細(xì)胞顯示出NDV和ROBO2蛋白對應(yīng)紅色和綠色熒光，而細(xì)胞爬片顯示兩蛋白熒光重疊的黃光，提示進(jìn)行兩種蛋白研究時，爬片法優(yōu)于滴片法。滴片法利于抗體熒光顯色，而爬片法利于兩抗體熒光重疊。激光掃描共聚焦顯微鏡具有高分辨率、高清晰度成像，三維重建及動態(tài)觀察的特點，在進(jìn)行高效細(xì)胞計數(shù)的同時進(jìn)行圖像處理，并對黏附生長的單個細(xì)胞或細(xì)胞群胞內(nèi)外的熒光作定量、定性、及時動態(tài)分析[16]。動態(tài)研究必須依賴于活細(xì)胞基礎(chǔ)[17]?，F(xiàn)今中外已普遍應(yīng)用激光共聚焦掃描動態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)不同的化學(xué)組分[18-21]，但目前較少應(yīng)用于樹突狀細(xì)胞的動態(tài)蛋白標(biāo)記研究中。細(xì)胞滴片和細(xì)胞爬片的制作有利于樹突狀細(xì)胞動態(tài)蛋白標(biāo)記研究，結(jié)合激光共聚焦掃描的激光顯微外科手術(shù)光子刀技術(shù)、籠鎖化合物技術(shù)，可深入到樹突狀細(xì)胞的呈遞機(jī)制和免疫應(yīng)答和細(xì)胞間通訊、膜流動性的研究。

4 結(jié)論

對單一蛋白研究時，細(xì)胞滴片陽性細(xì)胞比例更高，蛋白免疫反應(yīng)性更優(yōu)，利于標(biāo)記目的蛋白，研究胞內(nèi)蛋白表達(dá)變化以及進(jìn)行亞細(xì)胞定位。細(xì)胞爬片的制作方法簡便，可縮短試驗時間，易于維持細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和保持ROBO2蛋白特性，綜合顯色性更強(qiáng)，更有利于在體外研究骨髓源雞樹突狀細(xì)胞的ROBO2與新城疫病毒NDV的關(guān)系，為開展家禽抗病育種研究提供技術(shù)基礎(chǔ)和方法。激光共聚焦掃描作為一種分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，與細(xì)胞免疫熒光技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于檢測細(xì)胞內(nèi)外源蛋白表達(dá)情況，有助于進(jìn)一步提高細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)，利于深入研究樹突狀細(xì)胞等各種細(xì)胞的免疫功能、遷移作用和疫苗生產(chǎn)。