HPLC-MS/MS檢測血液病患者體內魯索替尼血藥濃度

王 磊，代玉超,王紅春，劉紅星,,4△

1.河北燕達陸道培醫(yī)院病理和醫(yī)學檢驗科，河北廊坊 065201；2.山東省日照市東港區(qū)婦幼保健院麻醉科，山東日照 276800;3.北京陸道培醫(yī)院病理和醫(yī)學檢驗科，北京 100176；4.北京陸道培血液病研究院，北京100176

魯索替尼是一種選擇性酪氨酸激酶-Janus激酶(JAK)抑制劑[1-3]，可以結合到JAK1和JAK2激酶上，抑制JAK1和JAK2信號，進而下調JAK1介導的促炎性細胞因子，調節(jié)JAK2相關促紅細胞生成及免疫細胞活化功能，還可抑制Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(JAK-STAT)通路，從而調整下游細胞的增殖作用，用于骨髓纖維化患者的治療。魯索替尼亦可以抑制T細胞分泌炎癥因子、增加受者體內調節(jié)性T細胞的數(shù)量，進而介導免疫耐受，還可以減少T細胞表面相關趨化因子或趨化因子受體進而改變T細胞遷移，是治療移植物抗宿主病(GVHD)的二線用藥，具有顯著的療效，同時保留移植物抗白血病效應[1-6]。魯索替尼是一種高效、選擇性強的小分子藥物，其口服后吸收快，1～2 h達血藥濃度峰值，在5～200 mg內，血藥濃度和曲線下面積(AUC)隨劑量增加而升高，呈線性關系，達穩(wěn)態(tài)后，其血漿蛋白結合率約為97%[7-8]；主要經(jīng)肝臟CYP3A4酶代謝，代謝物大部分從尿液排出，其消除半衰期約為3 h[4-6]；起始劑量是根據(jù)患者的血小板計數(shù)來確定的，并通常根據(jù)血小板計數(shù)來調整劑量。但魯索替尼藥動學個體差異大，且該藥與強CYP3A4酶抑制劑或強CYP3A4酶誘導劑合用，其暴露量會明顯增加(AUC增加91%)或減少(AUC減少71%)[4-5]，劑量增加會伴隨骨髓抑制增加，包括白細胞減少、貧血和血小板計數(shù)減低，且亦可發(fā)生急性耐藥[1-6]，且仍有一部分患者出現(xiàn)療效不佳或治療失敗，除考慮依從性、藥物間相互作用等可能的原因之外，還應考慮標準劑量是否為該部分患者的最佳治療劑量，是否實現(xiàn)了魯索替尼治療效益最大化，則需要通過檢測藥物濃度來判斷患者體內真實的魯索替尼濃度。目前，基于高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)定量檢測魯索替尼在血漿中濃度的研究較少，且大多采用固相萃取法同時檢測多個藥物的濃度[4-9]，前處理復雜，且耗時較長，不適合于本實驗室魯索替尼單藥的臨床檢測。由于HPLC-MS/MS具有專屬性好、靈敏度高、試劑成本低等優(yōu)點，故本實驗室采用HPLC-MS/MS檢測血液病患者魯索替尼血藥濃度，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取4例血液病患者的血液標本進行檢測?；颊呔鶠槟行裕挲g分別為17、33、37、65歲，檢測患者血漿標本中的魯索替尼濃度。

1.2儀器與試劑 Nexera Xp型高效液相色譜儀(日本島津公司)，帶自動進樣器和加熱器的色譜儀；API 3200 MD串聯(lián)四極桿質譜儀(美國AB Sciex公司)，自帶AB質譜工作站Analyst MD Version1.6.2(美國AB Sciex公司)。蒸餾水(廣州屈臣氏)；甲醇購自Fisher公司(HPLC-Grade)；甲酸和乙酸銨購自MREDA TECHNOLOGY INC(HPLC-Grade)；魯索替尼購自北京百靈威科技有限公司(LOT：LF70 P20)；魯索替尼-d9購自TRC公司(LOT：10-MMH-128-2)。

1.3方法

1.3.1儲備液制備 精密稱取標準品魯索替尼1.0 mg，置于小燒杯中，用適量甲醇溶解，轉移至10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，得到100 μg/mL魯索替尼母液，作為儲備液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笥眉状家来蜗♂寖湟?，得到魯索替尼濃度?5、50、100、250、500、1 000和2 500 ng/mL各標準系列工作液和7.5、25.0、200.0 ng/mL的各系列質控工作液。魯索替尼-d9亦依次經(jīng)過稱量、溶解、稀釋等操作，最終配置成濃度為25 ng/mL內標溶液，作為含有內標的沉淀劑使用。

1.3.2樣品制備 將待測EDTA-K2抗凝血3 500 r/min離心10 min后，取上層血漿100 μL，加入100 μL緩沖液(2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液)混勻，再加入300 μL魯索替尼-d9內標液，渦旋震蕩混勻1 min，13 000 r/min離心10 min。移取上清液170 μL置于進樣小瓶，自動進樣3 μL。

1.3.3高效液相色譜條件的設置 采用Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)，柱溫65 ℃；流速：0.7 mL/min；流動相：2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液(B)+0.1%甲酸甲醇溶液(A)，進樣量3 μL；洗脫方式：梯度洗脫，其中0.01～0.80 min，A相濃度從60%降低至5%，保持1.6 min；0.8～2.6 min，A相濃度從5%升高至60%，保持0.9 min。

1.4質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI+)；離子噴射電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；源內氣體1壓力：50 psi；氣體2壓力：50 psi；簾氣：20 psi；碰撞氣(N2)壓力：Medium；掃描方式為多重反應監(jiān)測(MRM)。用于定量分析的各種質譜條件參數(shù)見表1。同時對分析物的選擇性反應監(jiān)測進行了交叉討論，并對IS的校準曲線和工作溶液進行了最高標準的檢驗。采用二次、1/X2、最小二乘回歸算法繪制了選擇性反應監(jiān)測與濃度的峰面積比(魯索替尼/魯索替尼-d9)[10]。魯索替尼和魯索替尼-d9的碎片離子質譜圖分別見圖1A、1B，魯索替尼的色譜圖見圖1C。

表1 質譜條件

注：A為魯索替尼的質譜圖；B為魯索替尼-d9的質譜圖；C為魯索替尼的色譜圖。

1.5性能確證

1.5.1選擇性 選擇不含分析物和內標的雙空白血漿標本來反映系統(tǒng)的整體背景噪音，要求在預期的保留時間處背景噪音峰的峰面積低于分析物定量檢測下限(LLMI)峰面積的20%，并低于內標峰面積的5%[11-13]。

1.5.2攜帶污染率 選取高、低濃度樣本，按照“1.4”的處理方法進行處理，對不同的組合進樣，高-低值轉換樣本均值與低-低值轉換樣本均值的差小于低-低值轉換樣本的3SD[13]。在分析高濃度的樣本之后立刻進樣1份空白樣本，以評估殘留情況[10]。要求分析空白樣本時的檢測信號響應值應低于LLMI的25%[14-18]。

1.5.3基質效應 制備低、中、高(7.5、25.0、200.0 ng/mL)3個濃度的質控品，測定基質效應。通過將所提取的3個濃度的分析物和內標峰面積比與從純溶液制備獲得的分析物和內標峰面積比進行比較來確定基質效應。按照“1.4”的處理方法對樣本進行處理，在相同濃度下，低濃度質控品下的峰面積比變異系數(shù)(CV)應小于20%，中、高濃度質控品下的峰面積比CV應小于15%[13]。

1.5.4線性、分析測量范圍(AMR)、定量下限(LLOQ) 選取空白血漿90 μL 7份，分別加入濃度為25、50、100、250、500、1 000、2 500 ng/mL的魯索替尼標準品溶液10 μL，加入100 mmoL/L緩沖鹽溶液100 μL，加入100 ng/mL魯索替尼-d9溶液300 μL，渦旋振蕩60 s，10 000 r/min離心10 min。吸取上清液于樣品管中，自動進樣3 μL。經(jīng)HPLC-MS/MS分析，以魯索替尼與內標魯索替尼-d9峰面積比(Y)作縱坐標，以血漿魯索替尼濃度(X)為橫坐標，得到直線方程，采用線性方程組計算所有樣品在分析范圍內的預測濃度。采用加權最小二乘法進行線性擬合，做3批標準曲線，每天做1批，連續(xù)檢測3 d，記錄線性方程和相關系數(shù)(r)，權重為1/X2，要求r≥0.990，LLMI處的偏差在±20%以內，其余濃度點的偏差在±15%以內，CV<20%，以平均信噪比(S/N)=10時的濃度方法確定LLOQ。

1.5.5精密度和正確度 取低、中、高3個濃度的質控品，按照“1.4”的處理方法對樣本進行處理，分別于不同分析批、批內多次進樣(n=5)，連續(xù)檢測3 d，計算其批內和批間精密度和正確度。

1.5.6回收率 利用低、中、高3個濃度的質控品測定血漿回收率。將含有質控濃度的所有分析物質的血漿樣本也加入了各自的內標。按照“1.4”的處理方法對樣本進行處理，將萃取后空白血漿標本的峰值響應與被甲醇∶水(50∶50，v/v)稀釋后的空白血漿制備的低、中、高質控標準樣本的峰值響應進行比較，要求各濃度回收率在85%～115%，低濃度點在80%～120%，CV<15%。

1.5.7穩(wěn)定性試驗 穩(wěn)定性采取評估臨床樣本的短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、進樣器穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性。短期穩(wěn)定性考察質控工作液樣本放置于室溫24 h的穩(wěn)定性，長期穩(wěn)定性考察樣本儲存于-80 ℃冰箱30 d，進樣器穩(wěn)定性是將樣本經(jīng)過前處理后加入進樣小瓶內儲存24 h，凍融穩(wěn)定性是將樣本反復凍融3次進行考察，通過測量穩(wěn)定樣本相對于新制備的相同濃度樣本相應面積比響應(魯索替尼/魯索替尼-d9)來評價血漿中的穩(wěn)定性結果。選取低、中、高3個濃度的質控樣本，本實驗室進行了室溫6 h、4 ℃保存24 h、進樣器24 h、-20 ℃保存48 h和-80 ℃反復凍融3次5個重復試驗。如果重復性測定的CV不超過15%，平均準確度的CV在±15%以內，則穩(wěn)定性可以接受。

1.6統(tǒng)計學處理 采用Excel對數(shù)據(jù)進行整理。

2 結 果

2.1選擇性 不含分析物和內標的雙空白血漿標本在保留時間處背景噪音峰的峰面積遠低于分析物LLMI峰面積的20%。

2.2攜帶污染率 魯索替尼在最低點和最高點的峰面積分別為1 500.00、147 000.00；魯索替尼-d9在最低點和最高點的峰面積分別為39 100.00、53 100.00。在進樣線性最高點樣本后，立即進樣空白樣本的峰面積遠遠小于LLMI峰面積的20%，結果為0，無攜帶污染。

2.3基質效應 在相同的濃度下，低、中、高質控品下的峰面積比的內標校正因子分別為1.02%、0.90%、0.95%，CV為2%～10%，小于15%，符合最終的準確定量分析。見表2。

表2 測定基質效應過程中低、中、高濃度質控品下的峰面積比

2.4線性、AMR、LLOQ 結果顯示，魯索替尼血藥濃度在2.5～250.0 ng/mL內線性關系良好(r=0.996 7)。當S/N=10時，LLOQ為0.06 ng/mL。線性方程為Y=0.012X+0.009 49、Y=0.012X+0.004 58、Y=0.011 7X+0.001 66,相關系數(shù)r均≥0.995 0。

2.5精密度和正確度 對低、中、高3個濃度質控品的標本進行精密度和正確度評估，批內精密度分別為6.37%、3.81%和3.31%，批間精密度分別為4.25%、4.47%、2.68%，正確度均大于100%，見表3。

表3 精密度和正確度

2.6回收率 在低、中、高3個濃度質控品的平均提取回收率分別為96.55%、110.32%和106.24%，回收率分別為84.2%～108.2%、97.5%～114.1%和99.2%～113.5%。見表4。

表4 測定回收率過程中低、中、高3個濃度質控品下的峰面積比(n=5)

2.7穩(wěn)定性試驗 重復性測定的CV小于15%，平均準確度的CV在±15%以內，穩(wěn)定性可以接受，符合要求。見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(%，n=3)

2.8臨床應用 4例患者檢測結果見表6?？芍?，魯索替尼在不同疾病和不同患者中的血藥濃度與劑量不呈線性，差別較大。

表6 4例患者檢測結果

3 討 論

魯索替尼作為骨髓增殖性疾病的一線用藥和白血病患者移植后GVHD的治療用藥，其同一用藥劑量下不同患者血藥濃度結果不同，治療效果亦不同，且易受CYP450酶的誘導劑和抑制劑影響，對魯索替尼進行血藥濃度監(jiān)測就顯得尤為重要。本文采用HPLC-MS/MS測定血漿魯索替尼濃度，通過對HPLC-MS/MS條件的優(yōu)化，使得各項性能指標符合行業(yè)相關標準[19-21]，達到專屬性較好且無殘留(結果為0)；基質效應為2%～10%，小于15%，滿足臨床試驗的基本要求；線性較好(r=0.996 7>0.99)；批內和批間精密度均較小，其重復性好(精密度2.0%～8.1%)，說明該方法較穩(wěn)定；低、中、高3個濃度質控品的平均提取回收率分別為96.55%、110.32%和106.24%，說明試劑萃取效率高、完全，檢測結果正確度高，受相應基質干擾較??；對魯索替尼的穩(wěn)定性進行驗證，除了低濃度質控品(7.5 ng/mL)在-80 ℃反復凍融3次條件下的CV為14.78%(<15%)外，可能與人為操作有關，其余均<10%，說明魯索替尼受前處理方式和溫度及時間的影響較?。磺音斔魈婺嵛锢砘瘜W性質較穩(wěn)定，滿足臨床常規(guī)項目開展的要求。文獻[4-5]中建立的HPLC-MS/MS法，需要通過微柱或者針頭濾膜進行過濾，且有時需要氮吹進行富集，達到多種物質響應都較好的目的；且由于檢測多種物質，其總分析時間較長，并且每種待測物質不同時間都有自身的同位素內標。而本文前處理采用含有同位素內標的甲醇直接沉淀蛋白，操作簡單，并且總分析時間為每針3.5 min，提高了工作效率，符合本院患者進行魯索替尼血藥濃度測定的需要。由此可見，本實驗室建立的用于魯索替尼濃度測定的HPLC-MS /MS法具有較高的靈敏度，適用于對臨床標本進行定量檢測，能為臨床個體化用藥和藥物代謝動力學研究提供參考。