解淀粉芽胞桿菌SQR9親緣識別與辨別相關基因的篩選

嚴無瑕,仇美華,劉妍,薛妍生,陶麗麗,徐志輝*,沈標,張瑞福,沈其榮

(1.南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術研究重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物協(xié)同創(chuàng)新中心/資源與環(huán)境科學學院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省耕地質(zhì)量與農(nóng)業(yè)環(huán)境保護站,江蘇 南京 210029)

近年來,社會微生物學的研究正引起研究學者的廣泛關注,部分科學家不僅僅以微生物個體為研究對象,而是瞄準微生物整個種群及其內(nèi)部的復雜關系[1]。群居的生活方式意味著微生物個體之間存在廣泛的合作和沖突的行為[2]。微生物之間廣泛存在利他、合作、欺騙和競爭性行為,其中利他行為最受關注。利他行為對實施者產(chǎn)生負面作用,對行為接受者產(chǎn)生正面作用。例如,Spoering等[3]研究銅綠假單胞菌生物膜耐藥性時發(fā)現(xiàn):絕大多數(shù)生物膜中的菌株并不具備耐藥性,只有少部分菌株即使受到高濃度的抗生素沖擊后仍能存活,這部分菌株生長速度相對緩慢,相對于種群中其他菌株來說,將自己的遺傳基因傳給下一代的機會很小,他們的分工是在極端情況下,防止整個種群的滅亡,是一種利他的合作行為。

根據(jù)漢密爾頓原則,微生物必須通過一定的機制來保證受益者的親緣關系,一方面保證個體的無私行為是有意義的,另一方面防止合作關系中的欺騙行為[4]。微生物種群內(nèi)通過親緣識別來維持和穩(wěn)定合作行為[5]。Wall[6]首次提出微生物“親緣識別”作用模型,近親菌種通過親緣識別(kin recognition,主要通過細胞膜蛋白識別)和非親緣排斥(non-kin exclusion,主要通過分泌毒素)2個過程完成微環(huán)境內(nèi)的親緣種群富集(kin enrichment),保護了近親菌種合作行為的有序進行,其中非親緣排斥過程也稱為親緣辨別。研究較為深入的親緣識別機制是黏細菌中的外膜置換系統(tǒng)(out membrane exchange,OME)[6]。黏細菌細胞間的識別蛋白TraA/B相互匹配后不僅能實現(xiàn)蛋白、脂多糖等“公共物資”的交換,還能修復功能缺陷的細胞[7]。細菌素是一類常見的毒素,其靶細胞作用范圍較窄,一般針對近緣或同種的不同菌株,例如大腸桿菌素(colicins)[8]。細菌素經(jīng)傳遞系統(tǒng)(如五型、六型分泌系統(tǒng)等)或細胞溶解等方式釋放后,會與靶細胞上的特定細胞表面受體結(jié)合,并通過各種機制殺死它們。若靶細胞內(nèi)包含相應的免疫蛋白,則可被識別為同類而免受細菌素的毒害;若靶細胞內(nèi)無相應的免疫蛋白,則被識別為非同類細胞而被殺死[8-9]。

芽胞桿菌(Bacillus)是一種典型的廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性細菌,它們之間存在親緣辨別現(xiàn)象,但其親緣識別的機制尚未深入闡明。研究發(fā)現(xiàn),1 cm3土壤中分離的枯草芽胞桿菌依據(jù)不同的親緣關系能在游動(swarming)培養(yǎng)基上形成邊界(boundary)、半融合(intermediate)和融合(merge)狀態(tài),親緣關系近的菌株通過親緣協(xié)作過程(kin recognition system)加強合作(融合),而親緣關系遠的菌株通過非親緣排斥過程(non-kin exclusion system)抵御對方對自身資源的侵蝕[10]。解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9是本實驗室從黃瓜種植發(fā)病區(qū)的健康植株根際分離的1株根際促生菌,在盆栽和大田試驗中表現(xiàn)出顯著的促生和生防效果[11-12]。在實驗室條件下,菌株SQR9拮抗根際病原微生物、根際定殖和促進植物生長的分子機制都已基本闡述清楚[11,13],但菌株SQR9的親緣識別與辨別的研究還很薄弱。本研究首先利用實驗室已有突變體并通過轉(zhuǎn)座子突變篩選了大量的解淀粉芽胞桿菌SQR9的突變體,研究它們與親緣菌株之間Swarming對峙表型,最后通過基因敲除驗證,鑒定出解淀粉芽胞桿菌SQR9中參與親緣識別與辨別系統(tǒng)的部分基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9、FZB42、T-5和DSM7,模式菌株枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)168,菌株SQR9kz(攜帶質(zhì)粒pUBXC[14],在木糖誘導下易轉(zhuǎn)化,具有零霉素抗性基因)及本實驗室保存的野生型菌株SQR9的突變體庫。質(zhì)粒pMarA[15](含有轉(zhuǎn)座子TnYLB-1),具有紅霉素(Em)和卡那霉素(Km)抗性基因,為大腸桿菌-芽胞桿菌溫敏型穿梭載體。

1.1.2 試劑壯觀霉素(Spc)、紅霉素(Em)、卡那霉素(Km)、零霉素(Zeo)和木糖均購自于南京鼎思生物技術有限公司;Prime STAR HS DNA Ploymerase、2×FastTaqMaster Mix、T4DNA連接酶均購自于寶生物技術有限公司(TaKaRa)。細菌基因組提取試劑盒、One Step Cloning試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和PCR清潔回收試劑盒購自于南京諾唯贊生物科技有限公司,DL-4-氯苯丙氨酸購自于美國Sigma公司。

1.1.3 引物所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 供試培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母粉5 g,氯化鈉3 g,蒸餾水1 000 mL。Swarming培養(yǎng)基:15 mmol·L-1硫酸銨,8 mmol·L-1七水硫酸鎂,27 mmol·L-1氯化鉀,7 mmol·L-1檸檬酸鈉,50 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5),1 μmol·L-1硫酸鐵,10 μmol·L-1硫酸錳,0.6 mmol·L-1磷酸二氫鉀,0.86 mmol·L-1賴氨酸,0.78 mmol·L-1色氨酸,0.2%葡萄糖。MSgg固體培養(yǎng)基:5 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH7.0),100 mmol·L-1MOPS溶液(pH7.0),2 mmol·L-1氯化鎂,700 mmol·L-1氯化鈣,50 mmol·L-1氯化錳,50 mmol·L-1氯化鐵,1 mmol·L-1氯化鋅,2 mmol·L-1硫胺,0.5%甘油,0.5%谷氨酸,50 mg·mL-1色氨酸,50 mg·mL-1苯丙氨酸。

1.2 試驗方法

1.2.1 平板游動對峙試驗參照文獻[16-18],將LB平板上保存的解淀粉芽胞桿菌及其突變體接種到3 mL新鮮配制的Swarming培養(yǎng)液中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液稀釋到10-4(D600=0.5),接種1 μL菌液于Swarming培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)基接種2個菌株。待菌液風干后,于37 ℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)24 h。觀察并拍照。

1.2.2 生物膜平板對峙試驗將LB平板上保存的解淀粉芽胞桿菌及其突變體接種到3 mL新鮮配制的MSgg培養(yǎng)液中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液稀釋到10-4(D600=0.5),接種2 μL菌液于MSgg固體培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)基接種2種菌株。待菌液風干后,于30 ℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)3～7 d。觀察并拍照。

1.2.3 利用轉(zhuǎn)座子TnYLB-1構(gòu)建解淀粉芽胞桿菌SQR9的突變體文庫取10 μL SQR9kz種子液接種至含有零霉素的LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、170 r·min-1培養(yǎng)至D600為0.5左右,然后添加終濃度為5 mg·L-1的木糖,于37 ℃、170 r·min-1誘導1 h后,取200 μL菌液分裝至無菌的2 mL離心管中,加入5 μL pMarA質(zhì)粒,于30 ℃、100 r·min-1復蘇3～4 h,將菌懸液涂布于含有零霉素和卡那霉素雙抗生素的LB平板上(Zeo終質(zhì)量濃度為 20 μg·mL-1,Km為5 μg·mL-1),于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化子,接種至含20 μg·mL-1Zeo、5 μg·mL-1Km和1 μg·mL-1Em的LB液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、170 r·min-1培養(yǎng)12 h,提取質(zhì)粒DNA。以原始pMarA質(zhì)粒DNA為陽性對照,菌株SQR9基因組為陰性對照,利用引物 oAtnpFwd、oAtnpRev和oITR分別擴增出轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒Himar1片段和轉(zhuǎn)座子TnYLB-1片段,并對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。將驗證正確的轉(zhuǎn)化子SQR9-pMarA接種至含有1 μg·mL-1Em的LB液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)12 h,接種10 μL菌液于含有紅霉素的LB液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)18 h,將菌液稀釋至10-5～10-6倍,并取200 μL涂布于含5 μg·mL-1Km的LB固體培養(yǎng)基上,置于50 ℃高溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。隨機挑選3 000個單菌落,接種于每孔含100 μL LB液體培養(yǎng)基的無菌96孔細胞培養(yǎng)板中,于37 ℃、140 r·min-1培養(yǎng)3～4 h,每孔加入100 μL 30%無菌甘油,-80 ℃存放[16]。

1.2.4 SQR9轉(zhuǎn)座子突變體文庫的篩選與插入位點分析提取篩選出的目標突變體基因組,用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ于65 ℃水浴鍋反應16 h對其進行酶切,用PCR清潔回收試劑盒進行純化,回收目標突變株基因組片段。將純化后的酶切DNA產(chǎn)物用T4DNA連接酶于16 ℃ 自連環(huán)化12～16 h。取上述酶連反應產(chǎn)物10 μL作為DNA模板,采用引物oIPCR1和oIPCR2進行PCR擴增,并將片段送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序,測序引物為oIPCR3(表1),通過序列比對,找到轉(zhuǎn)座子在突變體中的插入位點。

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 菌株SQR9中鞭毛合成相關基因flhO定點敲除突變體的構(gòu)建基于PCR原理和反篩標記pheS的解淀粉芽胞桿菌基因敲除方法對菌株SQR9中的鞭毛合成相關基因flhO進行敲除[19]。利用ΔflhO-UF/UR、ΔflhO-DF/DR和ΔflhO-BF/BR引物,以菌株SQR9基因組為模板,分別擴增出Up同源臂、Down同源臂和Back同源臂及PS片段,各片段均采用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。將擴增得到的4個片段序列產(chǎn)物進行融合PCR。在含零霉素的LB試管中接種SQR9kz單菌落,于37 ℃、170 r·min-1培養(yǎng)12 h。取出10 μL菌液轉(zhuǎn)接于新鮮的含20 μg·mL-1零霉素的LB試管中,于37 ℃、170 r·min-1培養(yǎng)5 h(D600=0.5),添加終濃度為5 mg·L-1的木糖,于37 ℃、170 r·min-1誘導培養(yǎng)1 h后,吸取200 μL菌液至2 mL無菌離心管,加入40 μL上述4個融合片段,混合均勻,于37 ℃、100 r·min-1培養(yǎng)7～8 h,將菌懸液涂布于含有壯觀霉素的LB平板上(終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1),于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。在含壯觀霉素的LB試管中接種轉(zhuǎn)化子,于37 ℃、170 r·min-1培養(yǎng)至對數(shù)前期(D600=0.5),取出10 μL菌液涂布于含有20 mmol·L-1DL-4-氯苯丙氨酸的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng),挑取單菌落,提取基因組,以此為模板,利用ΔflhO-VF/VR驗證引物進行擴增,判斷是否發(fā)生正確的雙交換同源重組,并將片段送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同芽胞桿菌間識別關系的差異

許多性狀優(yōu)質(zhì)的芽胞桿菌接種到特定的生境中后,對原有土著微生物的生態(tài)性影響還不明確。研究發(fā)現(xiàn),利用芽胞桿菌群集運動表型能探索它們之間的識別關系[10]。從圖1可知:解淀粉芽胞桿菌SQR9(以下簡稱SQR9)與同種解淀粉芽胞桿菌(農(nóng)業(yè)生物肥料菌株FZB42和T-5及工業(yè)生產(chǎn)菌株DSM7)形成邊界表型,說明這些功能良好的微生物菌種(FZB42和T-5)與菌株SQR9相互間不傾向于接觸式合作。

圖1 解淀粉芽胞桿菌菌株SQR9與同源芽胞桿菌FZB42、T-5、DSM7、168形成邊界表型Fig.1 Boundary formation between swarms of Bacillus amyloliquefaciens SQR9 and strain FZB42,T-5,DSM7,168黑色箭頭表示邊界表型;白色箭頭表示融合表型;白色圓圈代表接種位置。下同。Black arrows indicate boundary phenotype;white arrows indicate merge phenotype;white circle indicate the inoculation location. The same as follows.

2.2 篩選SQR9中參與親緣識別與辨別的相關基因

為了探究菌株SQR9中參與其親緣識別和辨別的基因,通過2種方式進行研究。先利用已構(gòu)建好的突變體庫進行篩選,然后構(gòu)建菌株SQR9的轉(zhuǎn)座子突變體庫進行篩選。

2.2.1 利用SQR9已有突變體庫的篩選將菌株SQR9的32株突變體分別與野生菌株SQR9和FZB42進行Swarming對峙試驗,結(jié)果見表2和圖2。前期試驗表明,野生型菌株SQR9自己相互對峙時為融合表型,菌株SQR9與FZB42對峙時為邊界表型。突變體ΔsinR和ΔfliD與菌株SQR9對峙為邊界表型,而突變體Δspo0A與菌株FZB42對峙為融合表型,說明調(diào)控基因sinR和鞭毛合成相關基因fliD可能參與菌株SQR9的親緣識別過程,而調(diào)控基因spo0A可能參與其親緣辨別過程(圖2)。

表2 突變體與菌株SQR9、FZB42的游動對峙表型Table 2 Swarm interaction phenotypes of laboratory mutants with strain SQR9 and FZB42

圖2 菌株SQR9、FZB42與突變體ΔsinR、ΔfliD、Δspo0A的游動對峙表型Fig.2 Swarm interaction phenotypes between strains SQR9,FZB42 and ΔsinR,ΔfliD,Δspo0A mutants

2.2.2 轉(zhuǎn)座子突變庫中的突變體與野生型SQR9的Swarming對峙表型分析利用轉(zhuǎn)座子TnYLB-1成功構(gòu)建SQR9的3 000株突變體庫。將突變體與野生菌株SQR9和FZB42進行Swarming對峙試驗,挑出表型發(fā)生變化的菌株,利用反向PCR擴增測序的方法,進行突變位點分析。結(jié)果表明:7株突變體與菌株SQR9的Swarming對峙表型由融合變?yōu)檫吔?圖3);突變體的插入位點分別為srfAA、patB、gerAA、gerAB、flhO、yugK和degU(表3),這7個基因可能與菌株SQR9的親緣識別過程相關。

圖3 7株突變體與菌株SQR9的游動對峙表型Fig.3 Swarm interaction phenotypes between seven mutants and strain SQR9

表3 轉(zhuǎn)座子TnYLB-1插入的解淀粉芽胞桿菌SQR9突變體轉(zhuǎn)座位點分析Table 3 TnYLB-1 transposon insertion sites in mutants of B.amyloliquefaciens SQR9

2.3 鞭毛合成基因flhO缺失突變體(定點突變)的構(gòu)建

為了明確鞭毛合成相關基因flhO轉(zhuǎn)座突變體Swarming表型變化是否由該基因突變引起的,利用反篩標記pheS的解淀粉芽胞桿菌基因敲除方法(無痕敲除)敲除該基因進行進一步的驗證。利用融合PCR方法構(gòu)建4個融合片段FFS(4 446 bp,包含上游重復片段Up、相鄰基因片段Back、反篩標記pheS+壯觀霉素抗性片段PS和下游重復片段Down)(圖4-A),將FFS片段轉(zhuǎn)入菌株SQR9中后,PCR篩選正確的轉(zhuǎn)化子。由圖4-B可以看出,刪除500 bp的突變體B為正確的轉(zhuǎn)化子,突變體A為假陽性轉(zhuǎn)化子,正確轉(zhuǎn)化子命名為ΔflhO,并保存。

圖4 菌株SQR9中flhO基因的敲除以及突變體驗證Fig.4 Deletion of the flhO gene in strain SQR9 and verification of the mutantA. FFS融合片段構(gòu)建Construction of the FFS fusion fragment;B. 突變體驗證Verification of the mutant.

2.4 突變體ΔflhO、ΔdegU與野生型SQR9的平板對峙表型分析

全局性調(diào)控基因(spo0A、sinR和degU)、鞭毛合成相關基因(fliD和flhO)、芽胞萌發(fā)基因(gerAA和gerAB)、抗生素合成基因(srfAA)和其他基因(patB和yugK)參與菌株SQR9的親緣識別和辨別過程。全局性調(diào)控蛋白DegU能調(diào)控芽胞桿菌的鞭毛形成[20],所以猜測degU-flhO是菌株SQR9親緣識別的主要調(diào)控通路之一。2種對峙試驗表明,突變體ΔflhO、ΔdegU[21]與野生型菌株SQR9的對峙表型由原本的融合表型變成邊界表型,生物膜對峙同樣發(fā)現(xiàn)突變體與野生型形成類似邊界表型,相互之間不共享生物膜的公共物質(zhì)(胞外基質(zhì)),而其基因回補菌株恢復了野生型的表型,說明這2個基因的突變,影響菌株間的親緣識別過程(圖5)。

圖5 菌株SQR9與突變體ΔflhO、ΔdegU以及回補菌株SQR9-ΔflhO-flhO∷spc、SQR9-ΔdegU-degU∷spc的游動/生物膜對峙表型Fig.5 Swarm and biofilm interaction phenotypes between strains SQR9 and its mutants ΔflhO,ΔdegU and refeeding strain SQR9-ΔflhO-flhO∷spc,SQR9-ΔdegU-degU∷spc

3 討論

植物根際微生物被認為是植物的第二基因組,對宿主的營養(yǎng)吸收以及協(xié)助植物應對各類生物和非生物脅迫中起到關鍵作用,被寄望在農(nóng)業(yè)“綠色革命”時代發(fā)揮重要作用,因此應用植物根際促生菌(plant-growth-promoting microorganisms,PGPM)提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)是現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要趨勢之一[22]。近20年來,PGPM菌株在單菌水平上的研究揭示了其活化養(yǎng)分(溶磷、解鉀、固氮等)、植物促生激素(吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素等)、揮發(fā)性促生物質(zhì)(乙偶姻和2,3-丁二醇等)等的促生機制,以及通過抗生作用、競爭作用、誘導植物系統(tǒng)抗性等防控土傳病害的生物學機制[23-24]。提高物種多樣性可以增強群落功能多樣性和穩(wěn)定性,生產(chǎn)實踐中多種功能微生物組合使用的效果也更好[25]。然而,功能微生物的組合不是多種功能菌株的簡單混合,缺乏生態(tài)學理論指導的組合達不到預期的效果。解淀粉芽胞桿菌SQR9在盆栽和大田試驗中表現(xiàn)出較好的促生和生防效果,其促生抗病的分子機制已初步闡明,但其施入土壤后與其他土著芽胞桿菌的關系未知。本研究通過分子生物學手段,篩選出菌株SQR9中參與親緣識別與辨別的基因,為進一步闡明其生態(tài)學效應提供理論基礎。

枯草芽胞桿菌的親緣識別主要依賴非親緣排斥,而非親緣協(xié)作[14]。芽胞桿菌通過分泌大量多樣的抗生素和毒素進而創(chuàng)造一個屏障,只有關系相近的種才能夠共存,并通過直接針對并殺死非親緣種來進行間接識別[26]。變形菌門中部分細菌的接觸依賴性抑制(contact-dependent inhibition,CDI)系統(tǒng)是典型的非親緣排斥。同樣,該系統(tǒng)需要細胞間的黏附蛋白CdiA進行特異性的識別,細胞相互接觸后毒素物質(zhì)能通過五型分泌系統(tǒng)注入對方細胞,如有相關解毒蛋白即為近親,可繼續(xù)合作;反之,毒素物質(zhì)會在胞內(nèi)積累影響細胞的正常代謝[27]。本研究通過大范圍篩選突變體,發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌SQR9中的全局性調(diào)控蛋白DegU和鞭毛合成相關蛋白FlhO參與其親緣識別的過程。研究表明,低磷酸化水平的DegU蛋白也調(diào)控芽胞桿菌鞭毛的合成[20]。鞭毛是微生物表面特殊的附屬結(jié)構(gòu),前期的研究表明其主要與細菌運動能力相關[28]。近年來,科學家逐步發(fā)現(xiàn)鞭毛與宿主黏附、生物膜形成和免疫調(diào)節(jié)等作用有關,其抗原多態(tài)性可用于細菌分類[29]。本研究結(jié)果推測,芽胞桿菌的鞭毛蛋白可能與菌株間的親緣識別相關,因為定點突變flhO基因后其與野生型菌株的Swarming表型由融合變?yōu)榘肴诤?失去部分識別能力。研究發(fā)現(xiàn),鞭毛蛋白中存在非常保守的N末端和相對可變的C末端組成,其暴露在外的中央?yún)^(qū)具有一定的可變性,猜測與其親緣菌株的識別有關,但還需要進一步的證明[29]。

親緣識別過程是芽胞桿菌社會性行為的基礎。植物根表定殖試驗表明,親緣關系近的菌株組合能共同定殖于植物根表,而親緣關系遠的菌株組合只有一類芽胞桿菌能成功定殖,并通過非親緣排斥過程阻止其他芽胞桿菌定殖[10]。例如,生物有機肥料中常用的功能菌株SQR9與FZB42的Swarming形成邊界表型,菌株關系不利于接觸式合作。所以,深入研究芽胞桿菌的親緣識別分子機制,能為科學組裝復合型微生物肥料提供理論依據(jù)。