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    基于TCGA數(shù)據(jù)庫的腎嫌色細(xì)胞癌生物信息學(xué)分析

    2021-01-27 08:29:50瞿根義王佳威聶海波黃文琳
    現(xiàn)代泌尿外科雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:嫌色差異基因通路

    瞿根義,王佳威,徐 勇,陽 光,聶海波,黃文琳,湯 乘

    (中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院泌尿外科,湖南株洲 412007)

    腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是一種異源性疾病,由透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)和非透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(non-clear cell renal cell carcinoma,nccRCC)組成[1]。嫌色細(xì)胞癌(chromophobe renal cell carcinoma,chRCC),則是nccRCC第二常見的亞型,約占腎細(xì)胞癌亞型的4%~5%[2],發(fā)病年齡多為50~60歲,男女發(fā)病率無明顯差異[3]。雖然有研究表明具有局部chRCC和ccRCC的患者在5年生存率方面無顯著性差異(P=0.98)[4],但是大部分chRCC的患者預(yù)后比其他類型的RCC患者好,通常采取手術(shù)切除治療即可達(dá)到滿意的效果。然而對于部分進(jìn)展期、預(yù)后差的患者,往往需要免疫治療和分子靶向治療等輔助治療。目前,治療chRCC的靶向藥物療效不是十分明確,藥物依舊處在臨床試驗階段,需要長時間的觀測[5]。因此進(jìn)一步研究chRCC發(fā)病的相關(guān)基因,將有助于了解chRCC的發(fā)病機制和疾病進(jìn)展,并對尋找更加安全有效的治療措施有著舉足輕重的作用。

    TCGA數(shù)據(jù)庫作為當(dāng)前世界上最大的腫瘤基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫,具有大樣本和豐富臨床數(shù)據(jù)的優(yōu)勢。生物信息學(xué)則是將分子生物學(xué)和電子計算機相結(jié)合的技術(shù),可以為基因的研究提供明確的方向,幫助揭示大量生物信息中所含的奧秘。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對腎嫌色細(xì)胞癌的發(fā)病相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整合和分析,篩選出差異基因,并進(jìn)行基因富集(gene ontology,GO)分析和KEGG通路富集分析,制作PPI互作網(wǎng)絡(luò),以求尋找腎嫌色細(xì)胞癌發(fā)病及發(fā)展的關(guān)鍵基因,最終對挖掘到的關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析,為進(jìn)一步研究腎嫌色細(xì)胞癌的研究機制奠定生物基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料在TCGA Datasets(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據(jù)庫中以“chromophobe renal cell carcinoma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,并下載公開的關(guān)于腎嫌色細(xì)胞癌的基因組數(shù)據(jù),下載的基因組數(shù)據(jù)格式為FPKM。通過下載的基因組數(shù)據(jù)獲取臨床樣本量共89例,其中腎嫌色細(xì)胞癌樣本65例,正常組織24例。

    1.2 方法

    1.2.1獲取差異基因 應(yīng)用R軟件中的edgeR算法對腎嫌色細(xì)胞癌的數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異表達(dá)分析,根據(jù)差異倍數(shù)(log2)絕對值>2.5和FDR調(diào)整后P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因1 850個,其中表達(dá)上調(diào)基因760個,表達(dá)下調(diào)基因1 090個。并利用ggplot2軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形可視化。

    1.2.2差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫(DAVID;https://david.ncifcrf.gov)對篩選的顯著差異基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析,P<0.05為統(tǒng)計學(xué)具有顯著差異,應(yīng)用R軟件及相應(yīng)的clusterProfiler包進(jìn)行注釋及可視化。

    1.2.3Hub基因的篩選 STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)用于識別己知和預(yù)測蛋白與蛋白之間的相互作用[6-7]。使用STRING對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析并構(gòu)建蛋白互作(protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),采用Cytoscape軟件中的Cytohubba插件從STRING構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選獲取前10位Hub基因。

    1.2.4對關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析 利用R軟件對篩選獲取的關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析,并構(gòu)建Kaplan-Meier生存曲線,從而判斷關(guān)鍵基因與腎嫌色細(xì)胞癌預(yù)后關(guān)系。使用Log-rank檢驗評估關(guān)鍵基因的表達(dá)水平與腎嫌色細(xì)胞癌患者總生存率之間的生存差異,以P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因篩選該研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載、整理及分析了89例腎嫌色細(xì)胞癌患者的數(shù)據(jù),其中包含65個腎嫌色細(xì)胞癌樣本和24個正常樣本,利用R語言軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選,以P<0.05且差異倍數(shù)2.5倍為顯著差異獲取差異表達(dá)基因。共篩選出腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因1 850個,其中表達(dá)上調(diào)基因760個,表達(dá)下調(diào)基因1 090個,并繪制火山圖(圖1)和差異最顯著的前50個基因熱圖(圖2)。

    紅點:基于logFC>2.5且P<0.05篩選的下調(diào)基因;綠點:基于logFC<-2.5且P<0.05篩選的下調(diào)基因;黑點:沒有顯著差異的基因;FOR:差異倍數(shù)。

    2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果通過GO富集分析和KEGG通路富集分析篩選的差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,在GO富集分析中包括生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cell composition,CC)和分子功能(molecular function,MF),在BP中差異基因主要富集于跨膜轉(zhuǎn)運、化學(xué)突觸傳遞、膜電位調(diào)節(jié)和消化排泄,在CC中差異基因主要富集于質(zhì)膜的組成部分、質(zhì)膜、頂質(zhì)膜和細(xì)胞外區(qū)域,在MF中差異基因主要富集于激素活性、氧化還原酶活性和鈣離子結(jié)合,在KEGG通路分析中主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、視黃醇代謝、類固醇激素的合成。主要富集結(jié)果見表1、表2和圖3。

    圖2 腎嫌色細(xì)胞癌及癌旁正常組織差異表達(dá)最顯著的前50個基因熱圖

    表1 腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果

    表2 腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析結(jié)果

    A:差異基因GO富集可視化;B:差異基因KEGG通路富集可視化。

    2.3 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果通過STRING數(shù)據(jù)庫對腎母細(xì)胞瘤發(fā)病的差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape軟件中Cytohubba篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的連接程度前10位Hub基因(圖4),分別是:KNG1、AGT、CASR、SST、AGTR2、PMCH、GNG4、DRD2、MCHR2、SSTR3。

    2.4 關(guān)鍵基因的生存分析對排名前10位的Hub基因進(jìn)行生存分析,構(gòu)建出Kaplan-Meier生存曲線,發(fā)現(xiàn)只有MCHR2的表達(dá)對腎嫌色細(xì)胞癌患者的總生存率(overall survival,OS)影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其余基因的表達(dá)水平都與腎嫌色細(xì)胞癌無顯著相關(guān)性。

    圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的10 Hub基因

    A:KNG1;B:AGT;C:CASR;D:SST;E:AGTR2;F:PMCH;G:GNG4;H:DRD2;I:MCHR2;J:SSTR3。

    3 討 論

    腎嫌色細(xì)胞癌是起源于腎小管集合上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,雖然臨床上不常見,但是在nccRCC中,其發(fā)病率僅次于乳頭狀腺癌[8]。雖然chRCC少見且為低度惡性潛能的腫瘤,但是仍有部分預(yù)后差、進(jìn)展期的患者需要輔助治療。因此將chRCC各個時期與環(huán)節(jié)中共同表達(dá)的相關(guān)基因進(jìn)行深入研究,挖掘出疾病發(fā)生與發(fā)展中起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因,對了解疾病的機制、改進(jìn)疾病的治療措施以及相應(yīng)靶向藥物的研發(fā)十分重要。

    本研究致力于篩選并分析與腎嫌色細(xì)胞癌發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵基因,通過對TCGA數(shù)據(jù)庫檢索篩選共挖掘出腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因1 850個,其中包括了表達(dá)上調(diào)基因760個和表達(dá)下調(diào)基因1 090個。通過GO富集分析和KEGG富集分析來篩選與分析差異表達(dá)基因,最終得到各個差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。在BP中差異基因主要富集于細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運、化學(xué)突觸傳遞、膜電位調(diào)節(jié)等。在CC中差異基因富集于細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜。在MF中差異基因主要富集于氧化還原酶活性、鈣離子結(jié)合、K離子通道等。在KEGG通路分析中主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、視黃醇代謝、類固醇激素的合成。隨后進(jìn)一步通過STRING數(shù)據(jù)庫對腎嫌色細(xì)胞癌差異表達(dá)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白調(diào)節(jié)點主要集中在KNG1、AGT、CASR、SST、AGTR2、PMCH、GNG4、DRD2、MCHR2、SSTR3。

    激肽原(Kininogen 1,KNG1)重組蛋白參與機體各種生理活動,例如控制血管的擴張、維持水電解質(zhì)的平衡以及調(diào)控細(xì)胞的凋亡等[9]。如今越來越多的證據(jù)表明KNG1似乎具有抗血管生成的功能,并能阻斷內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,在癌癥的發(fā)生起到一定的作用[10]。此外還有研究表明,在癌癥患者的血清中檢測到KNG1基因的低表達(dá),因此KNG1可以作為癌癥和晚期大腸腺瘤的潛在血清預(yù)測因子[11]。編碼血管緊張素原的AGT則可以抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移,因為有研究已證實AGT能夠獨立于血管緊張素Ⅱ在機體內(nèi)產(chǎn)生非常強大的抗血管生成作用[12],實驗中AGT的過度表達(dá)能明顯降低腫瘤內(nèi)新生血管的形成,從而延緩了腫瘤的發(fā)展[13],這代表了AGT有望成為抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的新的研究方向。CASR基因在人體腎臟組織中廣泛表達(dá),對維持人體健康組織的鈣穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[14]。最近一項研究證明,在腎部分切除術(shù)后5年內(nèi)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞標(biāo)本中,CASR的表達(dá)最高[15]。研究也指出CASR的過度表達(dá)可能誘導(dǎo)RCC癌細(xì)胞的增殖潛能以及癌細(xì)胞的鈣依賴性粘附,從而增加骨轉(zhuǎn)移的概率[16]。此外,DRD2缺失也與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[17],大量研究顯示DRD2與結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞癌和胃癌的發(fā)病皆有關(guān)聯(lián)。這是因為DRD2具有遺傳多態(tài)性,這種多態(tài)性與細(xì)胞mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯的改變有關(guān)[18],DRD2密度的降低會減少對細(xì)胞生長的抑制及改變細(xì)胞內(nèi)凋亡信號,從而導(dǎo)致細(xì)胞的癌變,增加患癌癥的風(fēng)險。MCHR2是黑色素濃縮激素(Modifier of chinchilla,MCH)的受體之一,該基因位于人類第6號染色體長臂上[19]。本研究發(fā)現(xiàn)MCHR2是唯一與腎嫌色細(xì)胞癌患者的OS有顯著相關(guān)性的關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)MCHR2和肥胖癥密切相關(guān),MCHR2受到MCH的激活后調(diào)節(jié)下丘腦的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器,從而控制機體的飲食行為和能量消耗[20],特別是非典型抑郁癥患者M(jìn)CHR2基因的變異是其BMI升高的危險因素之一[21]。在腫瘤中尚無MCHR2基因的研究,本研究顯示MCHR2與腎嫌色細(xì)胞癌預(yù)后顯著相關(guān),因此MCHR2可作為腎嫌色細(xì)胞癌研究的新方向。

    本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出了與chRCC疾病發(fā)生與發(fā)展相關(guān)的基因,并挖掘及討論與腎嫌色細(xì)胞癌相關(guān)的關(guān)鍵基因。MCHR2有可能成為腎嫌色細(xì)胞癌潛在的治療靶點及預(yù)后標(biāo)志物。但是,由于與腎嫌色細(xì)胞癌相關(guān)的基因?qū)用娴难芯咳匀狈?,因此還需要大量的研究來闡明這些基因在腎嫌色細(xì)胞癌的發(fā)病機制中的生物學(xué)功能,并為腎嫌色細(xì)胞癌的治療提供新的線索和方向。

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