露蕊烏頭內(nèi)生真菌的分離與鑒定

劉欣瑜，黃恩霞，張書航，張 雨，朱燕麗，劉奕伶，王敬龍，孫 璐，宋潤杰，趙寶玉，路 浩*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西藏自治區(qū)青稞種質(zhì)改良和牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏拉薩 850000；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院草業(yè)科學(xué)研究所，西藏拉薩 850000)

烏頭屬植物在世界范圍內(nèi)大約有350種[1]，主要分布在歐亞和北美等地區(qū)[2]，其中我國物種資源最為豐富(約200種)，主要分布于甘肅、西藏、青海及其鄰近地區(qū)[3]。烏頭是我國的傳統(tǒng)藥用植物，其在強(qiáng)心、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗衰老等方面具有良好的藥理作用[4]。烏頭屬植物含有生物堿約70種，主要為二萜類雙酯型生物堿[5]。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為4大類，即C19、C20、C18-二萜生物堿和雙二萜生物堿[5]。其中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿為藥用價(jià)值較高的3種成分，且都屬于雙酯型二萜生物堿[6]。研究表明，雙酯型二萜生物堿均有劇毒，其中以烏頭堿的毒性最強(qiáng)，是烏頭的主要毒性成分[6]。各種動(dòng)物誤食烏頭屬有毒植物后，會(huì)表現(xiàn)以腹痛、腹瀉、流涎、嘔吐、瞳孔散大、呼吸困難和感覺麻痹等為主要特征的臨床癥狀，動(dòng)物最終因呼吸衰竭和心臟麻痹而死亡[7]，對畜牧業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了我國草原畜牧業(yè)健康發(fā)展。

植物內(nèi)生真菌指某一時(shí)期生活在健康植物組織器官內(nèi)部或者細(xì)胞間隙中且不引起植物產(chǎn)生明顯病癥的一類真菌[8]。通過長期進(jìn)化，這類真菌與被寄生的植物間形成了和諧的共生關(guān)系，植物可為內(nèi)生真菌提供生長場所與營養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生并代謝與宿主相近的次生代謝產(chǎn)物，這有利于植物的生長[9]。自1993年Stierle A等[10]從短葉紅豆杉中分離到1株產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇的內(nèi)生真菌后，關(guān)于藥用植物內(nèi)生真菌的研究受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。已有研究表明，烏頭屬植物中內(nèi)生真菌種類豐富，如滇南黃草烏中分布有鐮孢霉屬、毛殼菌屬等[11]，川烏中有毛殼菌屬、匐柄霉屬等[12]。

露蕊烏頭是毛莨科烏頭屬露蕊烏頭亞屬中的唯一一個(gè)植物品種[13]，其為多年生草木植物，主要分布于甘肅南部、四川西部、青海及西藏等地[3]，多生長于山地、草地和河邊等地。露蕊烏頭的全草可供藥用，用于治療風(fēng)濕、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀。目前，對露蕊烏頭的研究主要集中在其藥用成分的分離提取、藥效及毒性等方面[14]，而有關(guān)甘肅露蕊烏頭內(nèi)生真菌的種類與種群分布特點(diǎn)尚不清楚。鑒于此，本試驗(yàn)采用表面消毒法分離露蕊烏頭內(nèi)生真菌，運(yùn)用形態(tài)學(xué)和ITS序列分析技術(shù)進(jìn)行內(nèi)生真菌的種屬鑒定，研究結(jié)果可豐富烏頭屬內(nèi)生真菌的種群多樣性，并為后續(xù)露蕊烏頭內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)所用露蕊烏頭植物樣本于2015年8月采自甘肅省天祝藏族自治縣，對剛采集到的新鮮植物樣本作干燥處理之后帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆?，該植物樣品包含根、莖、葉、花和種子。

1.1.2 主要試劑 次氯酸鈉，廣東光華科技股份有限公司產(chǎn)品；無水乙醇，成都市克隆化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；瓊脂粉，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；真菌通用引物ITS1和ITS4，西安熱默爾生物科技有限公司產(chǎn)品；2×EsTaqMAsterMix(Dye)、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品；氯仿，西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品；異戊醇，西隴化工股份有限公司產(chǎn)品；混合酚，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；中性樹膠，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；霉菌培養(yǎng)箱，中儀國科科技有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司產(chǎn)品；TG16A臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘產(chǎn)品；BG-Power 600通用電泳儀，北京天誠產(chǎn)品；壓力蒸汽滅菌器，上海博訊產(chǎn)品；水平式電泳槽DYCZ-34A，上海全脈產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，SYNGENE公司產(chǎn)品； PCR基因擴(kuò)增儀，美國Biorad產(chǎn)品；XP基因擴(kuò)增儀，杭州博日公司產(chǎn)品。

1.1.4 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂20 g/L,馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 露蕊烏頭植物樣品的表面消毒 對提前采集并干燥保存處理過的露蕊烏頭植物樣品進(jìn)行表面消毒，將其根、莖、葉、花和種子使用去離子水沖洗掉表面泥沙和塵土等污染物，再使用去離子水浸泡2 h左右后于無菌實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上對整個(gè)植物組織進(jìn)行表面消毒。消毒的程序：用750 mL/L的酒精漂洗30 s；用無菌水漂洗1 min；用20 g/L次氯酸鈉漂洗2 min,由于次氯酸鈉的消毒作用較強(qiáng),因此將其消毒時(shí)間設(shè)置了不同梯度，并依據(jù)篩選出的最適消毒時(shí)間作適量調(diào)整；為洗去殘留的消毒水用無菌水漂洗1 min，并重復(fù)4次。完成表面消毒后，需做組織印記檢測，以此驗(yàn)證表面消毒的效果。組織印記檢測的程序：將最后一次清洗得到的滅菌去離子水滴入PDA培養(yǎng)基表面，在真菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1周左右，觀察其培養(yǎng)基表面是否有其他微生物生長。

1.2.2 露蕊烏頭內(nèi)生真菌的分離 將已進(jìn)行過表面消毒的植物組織用濾紙包裹好，吸干組織表面的水分后，用手術(shù)剪剪去樣品斷端的部分，再將根和莖剪成2 mm～5 mm，葉和花剪成3 mm×3 mm的小塊，由于露蕊烏頭的種子較小，故將其剪開保留其創(chuàng)面即可。在分離不同植物組織的過程中注意用酒精棉球進(jìn)行消毒操作，避免不同組織內(nèi)的真菌交叉。將剪好的組織塊或新鮮創(chuàng)面用無菌鑷子分別插入或緊貼PDA培養(yǎng)基內(nèi)，放置于真菌恒溫培育箱，置25℃培養(yǎng)。

1.2.3 露蕊烏頭內(nèi)生真菌的純化 培養(yǎng)1周后，待組織切口的邊緣長出具有明顯菌落差異的真菌時(shí)，用尖端菌絲挑取法，挑取頂端形態(tài)不同的菌絲至新的PDA培養(yǎng)基再培養(yǎng)，反復(fù)純化2次～3次，將得到的純化菌株培養(yǎng)并編號(hào)，作分離率(isolation rate,IR)分析，此種分析用于衡量露蕊烏頭各個(gè)組織部位(根、莖、葉、花、種子)受到內(nèi)生真菌浸染的程度，然后將已純化的菌株分別接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，在25℃條件下培養(yǎng)，待菌落長成一定大小后，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 露蕊烏頭內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定 密切觀察內(nèi)生真菌，并將已純化好的內(nèi)生真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，每日在固定的時(shí)間內(nèi)記錄菌落的生長狀況，包括菌落大小、顏色、形態(tài)等，同步將之前已純化好的內(nèi)生真菌接種于另一PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d～4 d，待菌落生長至一定階段，將無菌蓋玻片用消毒過的鑷子以45°斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，觀察幾天待菌絲爬上蓋玻片之后，及時(shí)取出并制作菌絲玻片，并在顯微鏡下觀察菌絲的生長狀況，孢子形態(tài)，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)以及是否有分枝、橫隔等微觀特征。將觀察和記錄到的特征和結(jié)果，參考《真菌鑒定手冊》[15]對內(nèi)生真菌的菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 露蕊烏頭內(nèi)生真菌基因組DNA的提取與5.8S rDNA-ITS序列鑒定 采用改良CTAB法提取已純化過的菌株DNA：將已純化的菌株接種至PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)，1周待菌絲長滿平板后，小心刮取菌絲放置于研缽中，加入液氮20 mL，迅速研磨至粉末狀；稱取已研磨破壁的菌絲粉末50 mg置于1.5 mL的離心管中，加入600 μL已在65℃水浴鍋中預(yù)熱的20 g/L CTAB緩沖液，完全顛倒混勻后，置于65℃水浴鍋中30 min，期間需重復(fù)混勻3次；將下述離心過程重復(fù)兩次，直至兩相液面無肉眼可見雜質(zhì)：取600 μL混合液(在-20 ℃預(yù)冷的混酚、氯仿和異戊醇溶液按25∶24∶1的體積比配置)，加入到已預(yù)熱完的離心管內(nèi)搖勻，置于室溫孵育20 min， 4 000 r/min離心5 min，移液槍取上清液置于新的1.5 mL的離心管中，隨后加入已配制好的氯仿、異戊醇混合液(氯仿∶異戊醇=24∶1，-20 ℃預(yù)冷)，搖勻，室溫孵育20 min，4 000 r/min 離心5 min；將上清液吸取至1.5 mL的離心管內(nèi)，加入50 μL 3 mol/L NaAc溶液和1 000 μL無水乙醇(-20 ℃預(yù)冷)輕輕顛倒混勻后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用700 mL/L的乙醇溶液(-20 ℃預(yù)冷)清洗沉淀3次，倒置于濾紙以便濾干余液，放于室溫將乙醇揮干取沉淀；最后加入10 μL～20 μL ddH2O溶解DNA，可置于65 ℃水浴鍋中10 min，利于加快溶解和除去其中殘留的DNA酶活性，將溶解后的DNA置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.8S rDNA-ITS片段擴(kuò)增采用15 μL的PCR體系，反應(yīng)體系組分為：真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各1 μL，DNA模版1 μL，2×EsTaqMaster Mix 4.5 μL，ddH2O 7.5 μL；該P(yáng)CR的反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，將PCR產(chǎn)物置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

將保存的PCR產(chǎn)物使用移液槍吸取5 μL進(jìn)行點(diǎn)樣，吸取同等體積的DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，小心倒入電泳液(1×TAE緩沖液)至剛剛沒過電泳膠，連接正負(fù)極后，開通電泳儀，電泳條件為：電壓120 V、電流500 A、30 min；電泳結(jié)束后，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果。若有明顯的電泳條帶，用移液槍吸取PCR產(chǎn)物20 μL至0.5 mL離心管中，標(biāo)記后送至測序公司進(jìn)行檢測。

1.2.6 露蕊烏頭內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析 將測序結(jié)果與EZ biocloud的DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選取比對結(jié)果中相似度100%或相似度最高(高于95%)并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定菌株種屬進(jìn)行鑒定；查閱《真菌鑒定手冊》[15]確定其所屬科、目、屬，再將所得露蕊烏頭菌株種屬作相對分離率(RF)分析，以此衡量不同組織不同菌屬的內(nèi)生真菌的優(yōu)勢度；使用MEGA5.05軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其自展次數(shù)為1 000次，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹判斷菌株之間的親緣關(guān)系，進(jìn)行進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 露蕊烏頭內(nèi)生真菌分離結(jié)果

對露蕊烏頭植物組織表面進(jìn)行面消毒，以20 g/L次氯酸鈉消毒時(shí)間作為時(shí)間梯度，分別接種平板后觀察發(fā)現(xiàn)，消毒時(shí)間為1 min和1.25 min的印記對照平板均被其他微生物污染，但在1.5 min和2 min的消毒時(shí)間下分離到的內(nèi)生真菌菌落總數(shù)最多，另據(jù)試驗(yàn)觀察，經(jīng)20 g/L次氯酸鈉消毒2 min的菌落生長較快，因此將消毒時(shí)間選為2 min，在此消毒時(shí)間下進(jìn)行分離純化得到的菌株，據(jù)其形態(tài)合并成33株，并將所得數(shù)據(jù)結(jié)果作分離率分析如表1所示，可知葉的分離率最高，莖、花和根次之，分離率最低的是種子。

表1 露蕊烏頭不同組織內(nèi)生真菌分離結(jié)果

2.2 露蕊烏頭內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

PDA培養(yǎng)基純化菌落，在培養(yǎng)過程中記錄下菌落的主要特征，觀察制作好的切片記錄顯微鏡下菌絲的結(jié)構(gòu)，表2主要菌屬代表的菌落形態(tài)學(xué)特征，將菌落形態(tài)學(xué)特征與《真菌鑒定手冊》[15]進(jìn)行比對后作初步鑒定。

表2 露蕊烏頭優(yōu)勢內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特征

2.3 露蕊烏頭內(nèi)生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

將提取DNA后的PCR產(chǎn)物所得到的測序結(jié)果放在NCBI上進(jìn)行Blast比對，相似度均高達(dá)96%上，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定進(jìn)一步確定后，得到分屬于2綱、3目、3科、4屬，共33種內(nèi)生真菌(表3)，其中有2種未命名。

表3 露蕊烏頭內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

2.4 露蕊烏頭內(nèi)生真菌的組織分布特點(diǎn)

整理鑒定結(jié)果并計(jì)算不同菌屬在不同組織的相對分離頻率，如表4所示，露蕊烏頭內(nèi)生真菌總相對分離頻率為93.94%。其中葉的內(nèi)生真菌相對分離頻率最高為39.39%，莖的內(nèi)生真菌相對分離頻率為18.18%，根的內(nèi)生真菌相對分離頻率為12.12%，花的內(nèi)生真菌相對分離頻率為15.15%，種子的內(nèi)生真菌相對分離頻率最低為9.09%。根據(jù)分離到的菌屬，青霉屬在露蕊烏頭植株內(nèi)的分離頻率最高(63.64%)，是露蕊烏頭內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌種，同時(shí)，青霉屬(Penicilliumsp.)在5種組織內(nèi)都存在，分布最廣泛，部分菌屬的菌落和菌絲形態(tài)如圖1所示。

表4 露蕊烏頭內(nèi)生真菌菌屬相對分離率

A.Y4的菌落；B.Y4的菌絲(400×)；C.Y2的菌落；D.Y2的菌絲(400×)；E.Y6的菌落；F.Y6的菌絲(400×)；G.Z2的菌落；H.Y2的菌絲(400×)A.The colony of Y4；B.The hyphae of Y4(400×)；C.The colony of Y2；D.The hyphae of Y2(400×)；E.The colony of Y6；F.The hyphae of Y6(400×)；G.The colony of Z2；H.The hyphae of Z2(400×)

2.5 露蕊烏頭內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將所得菌株的測序序列用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。33株菌株分屬于不同的真菌，根據(jù)進(jìn)化親緣關(guān)系可分為種群Ⅰ、種群Ⅱ和種群Ⅲ，自檢支持率分別為88%、96%和100%；根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，種群Ⅰ部分內(nèi)生真菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)可分為種群A和種群B，自檢支持率為84%、60%；種群Ⅱ除去族外菌株Y7和Y10，可進(jìn)一步分出種群C，自檢支持率為66%；種群Ⅲ除去族外菌株H6，可進(jìn)一步分出種群D，自檢支持率為87%。種群A內(nèi)除去族外菌株Z2，其余菌株為同一種群，自檢支持率為89%。種群B可分為2個(gè)種群，自檢支持率分別為97%和94%。種群D除去族外菌株H5，其余菌株為同一種群，自檢支持率為88%；而種群C無下屬的分支。

圖2 基于5.8S rDNA-ITS序列由鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

采用表面消毒法對甘肅露蕊烏頭植物組織樣本消毒，使用消毒劑消毒時(shí)，其是由表面緩慢向里滲透的，故消毒的時(shí)間越長，植物組織里的內(nèi)生真菌被殺滅的可能性越大，被分離出的內(nèi)生真菌種類越少，但作用的時(shí)間太短又不能殺滅其組織表面的其他微生物，也就達(dá)不到消毒的效果，所以需要篩選最佳的消毒時(shí)間。由于20 g/L次氯酸鈉的消毒作用較強(qiáng)且對內(nèi)生真菌造成的影響較小，因此本試驗(yàn)以20 g/L次氯酸鈉作為表面消毒濃度，并設(shè)置了不同的消毒時(shí)間梯度，需在印記檢查中篩選出20 g/L次氯酸鈉的最適消毒時(shí)間，結(jié)果顯示20 g/L次氯酸鈉消毒時(shí)間為1 min和1.25 min時(shí)，印記對照平板被其他微生物污染，而消毒時(shí)間為2.5 min時(shí)無菌落生長，因此，1.5 min和2 min為最佳消毒時(shí)間。路浩等[16]對急彎棘豆內(nèi)生真菌分離時(shí)觀察到的最佳消毒時(shí)間是2 min，表明不同屬植物的最佳消毒時(shí)間基本一致。另據(jù)試驗(yàn)觀察，經(jīng)20 g/L次氯酸鈉消毒2 min的菌落生長較快，進(jìn)一步證實(shí)了消毒過程對內(nèi)生真菌生長的影響。

本試驗(yàn)從露蕊烏頭中一共分離到33株內(nèi)生真菌，主要有青霉屬(Penicilliumsp.)、交鏈孢霉屬(Alternariasp.)、曲霉屬(Aspergillussp.)和籃狀菌屬(Talaromycessp.)。李治瀅等[12]從云南川烏中分離到的內(nèi)生真菌有毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)、匐柄霉屬(Stemphyliumsp.)等，表明烏頭屬植物的內(nèi)生真菌分布種類存在差異。由表1可以看出，烏頭不同組織的內(nèi)生真菌種屬分布情況明顯不同，葉的分離率最高，其次是莖、花和根，種子內(nèi)的分離率最低。楊凱等[17]從新疆白喉烏頭內(nèi)生真菌分離鑒定中發(fā)現(xiàn)其根受侵染頻率最高。孫璐等[18]從毛序棘豆植物的莖中分離到的內(nèi)生真菌最多，葉中分離到的較少，表明內(nèi)生真菌浸染植物的組織部位較為廣泛，不同環(huán)境不同植物所受內(nèi)生真菌侵染的程度存在較大差異。

將露蕊烏頭內(nèi)生真菌鑒定后的結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，青霉屬在露蕊烏頭組織內(nèi)的分布最為廣泛，是甘肅天祝露蕊烏頭的優(yōu)勢菌屬(相對分離頻率為63.64%)；而在滇南黃草烏中，鐮孢霉屬(Fusariumsp.)是莖部內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種類(占菌株數(shù)的18.92%)，也是滇南黃草烏植物內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬種，根部的優(yōu)勢屬種是毛殼菌屬(占根部內(nèi)生真菌的20.00%)[11]。

此外，Yang K等[19]通過對新疆白喉烏頭內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的檢測，成功篩選出產(chǎn)烏頭堿的菌株；李桂瓊等[20]通過對碧江烏頭內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與其寄生植物組織相同或相似的活性成分，這為從露蕊烏頭及其他藥用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵液中尋找具有重要藥理活性化合物提供了試驗(yàn)依據(jù)。

通過對露蕊烏頭各組織內(nèi)生真菌的分離與鑒定，共獲得4屬33種內(nèi)生真菌；在露蕊烏頭各組織種，內(nèi)生真菌對葉的侵染頻率最高，莖次之，種子最少。青霉屬是露蕊烏頭植株的優(yōu)勢菌屬。