靶向SynDIG1的shRNA慢病毒載體的構建及功能鑒定

李亞琳，史秀超，權美平

(渭南師范學院環(huán)境與生命科學學院， 陜西渭南 714099)

突觸分化誘導基因(synapse differentiation induced gene 1，SynDIG1)是一種高度保守的跨膜蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性突觸傳遞和突觸可塑性調節(jié)中起著重要的作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)SynDIG1是α-氨基-3-羥基- 5-甲基-4-異惡唑丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isooxazolpropionic acid，AMPA)受體上的調節(jié)蛋白，SynDIG1表達水平的改變會引起突觸中AMPA受體的明顯改變[2]。研究小組把神經(jīng)細胞從大鼠的海馬體神經(jīng)元中分離出來，經(jīng)過檢測，發(fā)現(xiàn)SynDIG1和AMPA受體同時存在于突觸后膜，并在突觸形成的早期階段就已經(jīng)存在。SynDIG1可通過跨膜突觸調節(jié)分子調控突觸前蛋白，進而影響突觸發(fā)育，還可以激活AMPA受體表達，通過胞吐作用將AMPA受體轉移，進而促進突觸發(fā)育[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)通過調節(jié)神經(jīng)細胞中的SynDIG1表達水平，能夠改變突觸的數(shù)量和質量。SynDIG1表達降低時，AMPA受體的數(shù)量減少，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體的傳遞速率降低，同時突觸變小，數(shù)量也會減少；反之，當SynDIG1表達增強，會促進AMPA受體的形成使其數(shù)量增加，NMDA受體的傳遞速率提高，突觸會更加成熟穩(wěn)定，這表明SynDIG1對突觸形成、發(fā)育以及壽命等有著至關重要的作用[4]。但是，SynDIG1促進突觸發(fā)育和調節(jié)突觸可塑性的分子機制尚不明確。

隨著分子生物學研究技術的發(fā)展，基因敲除和基因敲減技術的應用也越來越廣泛。從最早的自殺質粒，到RNA干擾以及鋅指核糖核酸酶技術，雖然現(xiàn)在也發(fā)展了CRISPR基因編輯技術，但基于慢病毒載體的shRNA基因敲減技術在實驗室研究中仍然被普遍應用[5-6]。為了探索SynDIG1在突觸分化發(fā)育以及神經(jīng)傳導中的作用機理，本研究以人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的質粒pLKO.1為載體，構建靶向SynDIG1的shRNA，從而人為降低SynDIG1的表達量，為分析該蛋白在突觸分化以及可塑性調節(jié)中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質粒 從懷孕18 d的大鼠胚胎腦組織分離出海馬區(qū)神經(jīng)元細胞，進行原代培養(yǎng)；HEK293T細胞,購自空軍醫(yī)科大學實驗動物中心；PLKO.1-GFP質粒、慢病毒包裝載體，美國Addgene Cambridge MA公司產(chǎn)品。

1.1.2 抗體和試劑 鼠抗Tubuin(1∶5 000)，美國Sigma-Aldrich，St.Louis，MO公司產(chǎn)品；鼠抗SynDIG1(蛋白印跡1∶1 000，免疫熒光1∶500)，英國Abcam Cambridge公司產(chǎn)品；辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG，(1∶5 000)，美國Bio-Rad,Hercules，CA公司產(chǎn)品；Alex Fluor 594標記的羊抗鼠IgG(1∶700)，美國Invitrogen，San Diego，CA公司產(chǎn)品。T4 DNA Ligase、AgeⅠ-HF、EcoRⅠ-HF、CutSmart、T4PNK Kinase、CIP，美國New England Biolabs，Ipswich，MA公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000，美國Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA公司產(chǎn)品；PEI質粒提取試劑盒，美國Sigma-Aldrich，St.Louis，MO公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設備 冷凍高速離心機(5810R)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR儀器(T100 Thermal Cycler,CA)、凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc MP)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(NanoDrop2000，MA)、生物安全柜(1300 A2)，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱(力康HealForce,HF90)；倒置熒光顯微鏡(CKX41)，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)細胞元代培養(yǎng) 懷孕18 d的大鼠，取其胚胎并分離腦皮質和海馬組織進行原代培養(yǎng)。組織先用含有木瓜蛋白酶的Hanks平衡緩沖液在37 ℃消化15 min，然后用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)配制的包含1 mg/mLDNA酶、10 mg/mL卵脂黏蛋白、10 g/L牛血清白蛋白的研磨緩沖液研磨，直到神經(jīng)元完全分離。分離的海馬神經(jīng)元計數(shù)并接種于提前用多聚賴氨酸包被的60 mm培養(yǎng)皿或6孔板中進行培養(yǎng)。初分離的細胞用包含100 mL/L胎牛血清(Atlanta Biologicals，F(xiàn)lowery Branch，GA，USA)、50 mL/L馬血清、60 mg/L的L-半胱氨酸，10 mg/mL青霉素/鏈霉素(Corning，Corning，NY，USA)和60 mg/L L -谷氨酰胺的DMEM進行培養(yǎng)。細胞接種的第2天更換包含10 mL/L馬血清、20 mL/L胎牛血清、10 mg/mL青霉素/鏈霉素和60 mg/L L-谷氨酰胺的DMEM營養(yǎng)培養(yǎng)基，之后3 d更換1次營養(yǎng)培養(yǎng)基，直到細胞被用。

1.2.2 shRNA設計 GenBank查到大鼠SynDIG1基因mRNA序列，用siRNA Wizard v3.1(Invivogen,San Diego,CA)找出靶點序列并設計1對21-mer的SynDIG1 shRNA序列(下劃線部分)，根據(jù)pLKO.1的shRNA Oligos設計原則設計出1對引物，引物序列如圖1所示，5＇端設計有AgeⅠ (CCGG)和EcoRⅠ(AATT)酶切位點以便克隆到pLKO.1-GFP載體上。

圖1 靶向SynDIG1的shRNA Oligos引物(下劃線為shRNA序列)Fig.1 Sequences of shRNA Oligos targeting SynDIG1(underline shows shRNA sequence)

1.2.3 載體構建 合成好的Oligos用ddH2O溶解成100 μmol/L,2條引物進行退火，反應體系如下：正向反向引物各1 μL，10×NE buffer 5 μL， ddH2O 43 μL,共50 μL。反應條件如下：95 ℃ 5 min;70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20 ℃各30 min，最后16 ℃終止反應。得到的退火產(chǎn)物用PNK進行末端磷酸化，反應體系：T4PNK Kinase 1 μL,10×T4DNA Ligase buffer(含ATP)5 μL，退火產(chǎn)物50 μL，共56 μL體系在37 ℃反應1 h。

質粒PLKO.1-GFP用AgeⅠ-HF、EcoRⅠ-HF和Cut Smart 37 ℃反應1 h進行消化，然后用CIP 37 ℃ 30 min進行去磷酸化阻止質粒自連。得到的產(chǎn)物進行8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，切下7 kb的大片段用QIAGEN凝膠回收試劑盒進行純化，用ddH2O溶解并調整溶度到100 ng/μL。

處理好的shRNA和質粒PLKO.1-GFP進行連接反應。體系如下：PLKO.1-GFP消化產(chǎn)物 0.7 μL，oligo退火產(chǎn)物4 μL，T4Ligase 1 μL，10×T4DNA Ligase buffer(含ATP) 2 μL，ddH2O 12.3 μL，共20 μL，室溫反應90 min。同時做一個不加shRNA的陰性對照。

1.2.4 重組克隆子篩選 取出-80 ℃凍存的感受態(tài)菌DH5α(40 μL分裝)，冰上融化后，加入20 μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻置冰上20 min，42 ℃ 熱激1 min，快速置于冰上冷卻2 min，加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基400 μL，37 ℃、200 r/min搖床上旋轉1 h使細菌復蘇，所有的轉化細菌涂于預熱的含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)18 h。

1.2.5 DNA測序 挑選陽性克隆子重懸于3 mL的LB培養(yǎng)液37 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，QIAGEN試劑盒進行質粒抽提并測定DNA濃度。用25 pmol的PLKO.1通用引物和重組質粒約800 ng共15 μL體系進行測序。對陽性克隆子進行培養(yǎng)并抽提其質粒DNA。

1.2.6 病毒包裝 用pLKO.1 慢病毒包裝載體pLP1、pLP2、pLP VSV-G以及質粒pLKO.1-GFP(對照)和pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA共轉染HEK293T細胞，用DMEM和轉染試劑PEI轉染48 h，收集上清15 mL，1 200 r/min 5 min離心去除細胞殘渣，PEG 4 ℃過夜沉淀病毒，5 mL PBS溶解病毒并分裝保存于-80 ℃。

1.2.7 細胞轉染和感染 用Lipofectamine 2000轉染試劑盒，轉入重組pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA到細胞進行功能驗證，HEK293T細胞在70%～80%飽和度時轉染，海馬神經(jīng)細胞在DIV11(daysinvitro)時轉染。將目的DNA和轉染試劑lipofectamine分別與50 μL的OPTI-MEM混合后靜置5 min，DNA和轉染試劑比例為1 μg∶1 μL，然后將這兩者混合室溫孵育20 min。總體積約100 μL的混合液加到細胞中，十字晃動孔板混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染4 h后，用預熱的新鮮培養(yǎng)基替換掉轉染試劑，繼續(xù)培養(yǎng)。

包裝好的慢病毒重組病毒顆粒從冰箱取出后室溫放置10 min，徹底融化后直接加入孔板原代培養(yǎng)的DIV14或DIV2的大鼠海馬神經(jīng)細胞，200 μL/孔，24 h后換上新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7、9、12 d。

1.2.8 免疫印跡 HEK293T細胞以1×105個/ 孔接種于6孔板，第2天用pLKO.1-GFP和HA-SynDIG1(對照組)以及 pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA 和HA-SynDIG1(試驗組)進行共轉染24 h。原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細胞分別加入之前包裝好的Lentivirus，分別感染7、9、12 d。

處理結束后提取細胞總蛋白，進行100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉膜。用脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天取出膜，洗凈后加入HRP標記的IgG二抗(1∶4 000),室溫雜交1 h。加入ECL顯色， 凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白表達情況。

1.2.9 免疫熒光化學 DIV11海馬神經(jīng)細胞用Lipofectamine 2000試劑分別轉染pLKO.1-GFP和pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA 48 h。用冰冷的ACSF(artificial cerebrospinal fluid)清洗2次，在40 mg/mL多聚甲醛溶液中室溫固定10 min，然后用3 mL/L Triton X-100滲透細胞膜10 min，PBS洗3次，100 mg/mL羊血清封閉1 h，加入SynDIG1一抗4 ℃孵育過夜。第2天取出細胞，用PBS洗滌后，再與Alexa594標記的熒光二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌后用抗淬滅試劑封片，熒光顯微鏡觀察細胞中SynDIG1的表達并拍照。

2 結果

2.1 pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA重組質粒的獲得

pLKO.1-GFP用AgeⅠ-HF和EcoRⅠ-HF消化后，得到7 kb和1.9 kb的2個片段(圖2)。7 kb片段純化后與退火的SynDIG1 shRNA連接，得到5個陽性克隆子，測序后有3個提前終止反應，其余2個序列正確。

圖2 用AgeⅠ-HF和EcoRⅠ-HF消化pLKO.1-GFP

2.2 重組質粒在HEK293T細胞中抑制外源SynDIG1的表達

HEK293T細胞為人胚腎細胞，插入SV40 T-抗原的溫度敏感基因后產(chǎn)生的高轉染效率的衍生株，本身并不表達SynDIG1。用序列正確的2個陽性pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA質粒與HA-SynDIG1共轉染HEK293T細胞，24 h后檢測SynDIG1在其中的瞬時表達。如圖3所示，可以看到2個重組質粒都能敲減外源SynDIG1的表達，質粒1敲減率為38.2 %，而質粒2敲減率為74.8 %。與對照比較，兩個質粒對SynDIG1表達的敲減差異均極顯著(P<0.01)。

A.SDS-PAGE;B.表達量；**P<0.01A.SDS-PAGE;B.Expression level；**P<0.01

2.3 重組質粒對神經(jīng)細胞中SynDIG1表達的抑制

用重組質粒2轉染DIV11神經(jīng)細胞48 h，然后進行免疫熒光染色檢測SynDIG1的表達。如圖4所示，pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA重組質粒能夠敲減神經(jīng)細胞中SynDIG1的表達，對細胞胞體中SynDIG1敲減率達到46.6 %，具有極顯著差異(P<0.01)；而在細胞樹突，其敲減率為28.7%，具有顯著差異(P<0.05)。

A.免疫熒光染色;B.表達量A.Immunofluorescence staining;B.Expression level

2.4 SynDIG1 shRNA慢病毒感染對神經(jīng)細胞中SynDIG1表達的影響

用包裝好的慢病毒顆粒分別感染DIV2和DIV14神經(jīng)細胞，試驗隨機選擇的感染時間為7、9、12 d。由圖5可以看出病毒感染后，SynDIG1的蛋白表達明顯降低，而且DIV2細胞中SynDIG1蛋白敲減率明顯高于DIV14細胞，達到75%以上。

A.SDS-PAGE;B.表達量A.SDS-PAGE;B.Expression level

3 討論

通過RNA干擾或RNA沉默進行基因敲除或敲減是研究基因功能的一種常用方法。在哺乳動物細胞中，RNA干擾(RNAi)或RNA沉默可以通過瞬時siRNA(small or short interfering RNA)轉染或通過穩(wěn)定的shRNA (short hairpin RNA)導入來實現(xiàn)。已經(jīng)有很多載體可以高效攜帶shRNA，而慢病毒載體是一種常用的shRNA運載工具，可以將shRNA帶到哺乳動物細胞中并長期穩(wěn)定的表達，能夠感染神經(jīng)細胞、造血干細胞、肝細胞等大多數(shù)細胞，具有基因片段容量大，免疫反應小等優(yōu)點[7,8]。另外，作為載體的病毒一般都是缺陷型的，因此不會導致細胞死亡，被感染的細胞也能夠連續(xù)傳代增殖[9]。

Addgene公司開發(fā)的pLKO.1具有抗嘌呤霉素基因，可在哺乳動物細胞中進行選擇，也有助于陽性克隆子的篩選，并且可以通過適當?shù)陌b產(chǎn)生慢病毒顆粒[10]。含有shRNA的質粒載體轉染到細胞后，可與靶基因序列結合，阻止基因轉錄表達。經(jīng)包裝得到的慢病毒微粒感染細胞后，將shRNA序列引入到宿主細胞染色體，穩(wěn)定表達發(fā)卡RNA，從而沉默靶基因的表達[11]。慢病毒載體因其穩(wěn)定性較好而被廣泛用于基因功能的研究中，而且基于 pLKO.1質粒載體建立的shRNA數(shù)據(jù)庫也在逐漸擴大，這些資源為科學家研究特定基因的功能及其與其他基因的相互作用提供了有力的工具。

本研究以pLKO.1-GFP為載體構建了pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA，得到的陽性克隆子在測序過程中，有3個提前終止，說明載體本身純度不夠，最終僅得到兩個正確的SynDIG1 shRNA。這些SynDIG1 shRNA不僅能夠敲減HEK293T細胞中人為轉入的外源SynDIG1的表達，也能夠減少大鼠海馬神經(jīng)元細胞中內源性SynDIG1的表達，其敲減率達到了75 %。同時，用pLP1、pLP2、pLP VSV-G這3種包裝質粒對pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA包裝后形成的慢病毒，也能夠有效并穩(wěn)定的降低神經(jīng)細胞中固有SynDIG1的表達，而且病毒感染時間越早，內源性SynDIG1的敲減效率也越高。本試驗中DIV14神經(jīng)細胞感染pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA慢病毒顆粒后，SynDIG1蛋白的敲減程度明顯低于DIV2，這是因為DIV14神經(jīng)細胞在病毒感染之前就已經(jīng)產(chǎn)生了SynDIG1蛋白，并且在神經(jīng)細胞中積累，在突觸發(fā)育的早期發(fā)揮作用。而病毒感染只能阻止SynDIG1基因的轉錄，不能影響已經(jīng)形成的SynDIG1蛋白，從而使DIV14神經(jīng)細胞中檢測到的SynDIG1蛋白增加。通過利用HEK293T以及大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞所做的試驗，證明了本研究得到的重組pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA能夠有效并穩(wěn)定地敲減外源性以及內源性SynDIG1靶基因的表達。

本研究用pLKO.1-GFP作為載體，成功構建了靶向SynDIG1的pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA，該重組質粒以及包裝后的慢病毒均能夠有效地抑制內源性及外源性SynDIG1的表達，為SynDIG1的功能研究提供一個有力的工具，也為基于慢病毒載體的其他基因的shRNA載體構建提供了參考方法。