羊口瘡病毒在羔羊4種原代細(xì)胞中的增殖特性研究

常建軍，陳 曦，王天星，景 添，李瑞蕊，郭含薇，劉啟龍，王 勇，李 莉，陳德坤*，文 英*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

羊口瘡(Orf )又稱傳染性膿皰(contagious ecthyma)，是一種急性、接觸性的人獸共患傳染病。羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)屬于痘病毒科副痘病毒屬，主要感染綿羊和山羊[1-2]。該病主要危害羔羊，感染的動物通常在嘴唇、蹄、乳房和外陰的皮膚上有紅斑、丘疹、癤子、潰瘍和疣狀的厚老繭等明顯臨床癥狀，傳染性極強，發(fā)病后繼發(fā)葡萄球菌或鏈球菌等細(xì)菌感染，致死率可達(dá)90%[3-4]。羊口瘡最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，而后幾乎所有山羊和綿羊養(yǎng)殖場的國家和地區(qū)均有該病發(fā)生[5-6]，我國甘肅、青海、新疆、陜西、云南等多地均有報道[7-9]。羊口瘡高發(fā)季節(jié)，新生羔羊感染率可達(dá)90%[10]，感染羊只由于生產(chǎn)性能的下降給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

已有研究表明，ORFV可以在體外適宜的宿主細(xì)胞上進(jìn)行增殖，其宿主范圍較廣。在20世紀(jì)60年代，一些學(xué)者在羊胚胎原代細(xì)胞上成功復(fù)制此病毒，但細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)并不明顯。此后，Sands J J等[11]和Plowright W等[12]相繼在犢牛睪丸原代細(xì)胞、羔羊睪丸原代細(xì)胞上成功增殖了羊口瘡病毒，并觀察到了典型的細(xì)胞病變。1987年，Balassu T C等[13]研究了ORFV N27株在新生犢牛睪丸細(xì)胞上的增殖特性，結(jié)果顯示病毒感染細(xì)胞之后的4 h～6 h病毒DNA開始復(fù)制，8 h～16 h病毒DNA大量聚集，25 h～30 h病毒DNA量達(dá)到穩(wěn)定。Pye D[14]利用羔羊腎細(xì)胞系、Mercante M T等[15]用雞胚成纖維細(xì)胞均成功增殖了羊口瘡病毒。

目前，ORFV在各類羔羊組織原代細(xì)胞的增殖和致病變特性尚不清楚。本研究用4種羔羊原代細(xì)胞和分離純化的ORFV FX毒株，以確定體外培養(yǎng)的4種羔羊原代細(xì)胞中感染ORFV的靶細(xì)胞，并比較ORFV在不同羔羊組織細(xì)胞的偏好性，以期為后續(xù)羊口瘡的研究和防控提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 羔羊腎外膜上皮細(xì)胞、口唇表皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和睪丸原代細(xì)胞,均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室分離保存。

1.1.2 毒株 羊口瘡病毒FX毒株，由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室分離鑒定[16]，置-80 ℃保存。

1.1.3 主要試劑 MEM、DMEM/F12(DF12)培養(yǎng)基和2× EsTaqMasterMix，北京康為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胎牛血清(Fatal bovine serum,FBS)，美國Sigma公司產(chǎn)品；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、微型水平電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；移液器(1 mL、100 μL、10 μL)，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；冰箱，青島海爾公司產(chǎn)品；電子天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊有限公司設(shè)備廠產(chǎn)品；PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；電泳儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；紫外凝膠成像儀，南京世研儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇州三星凈化有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，濟(jì)南鑫貝西有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將凍存的羔羊腎外膜上皮細(xì)胞、口唇表皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和睪丸原代細(xì)胞在38 ℃～42 ℃的水中快速融化，分別將細(xì)胞吸入一個T25細(xì)胞瓶內(nèi)，加入10 mL FBS濃度為100 mL/L和含10 000 U青霉素和鏈霉素的DF12培養(yǎng)基(100 g/L DF12)，置于37 ℃、 體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，細(xì)胞進(jìn)行全換液。48 h～72 h，待單層細(xì)胞鋪滿瓶底，用無菌PBS清洗3次，加入5 mg/mL的胰酶1 mL消化，輕柔晃動細(xì)胞瓶以保證胰酶均勻作用于所有細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞全部變圓時，立即加入1 mL 100 g/L DF12終止消化，輕輕拍打細(xì)胞瓶，將DF12培養(yǎng)基補至10 mL。按照上述步驟連續(xù)傳代3次后，調(diào)整細(xì)胞密度，將細(xì)胞懸液分別轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加1 mL細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加100 μL細(xì)胞懸液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 病毒復(fù)壯與接種 復(fù)蘇并培養(yǎng)牛睪丸上皮細(xì)胞，具體操作步驟同1.2.1。向上述復(fù)壯的細(xì)胞中接種1 mL的ORFV FX株病毒液，并設(shè)加入1 mL的20 g/L MEM作為對照，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60 min后，均補充20 g/L MEM至10 mL，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)80%細(xì)胞發(fā)生病變時，將細(xì)胞瓶在-80 ℃反復(fù)凍融3次，傳代至出現(xiàn)典型CPE。取12孔板中羔羊腎外膜上皮細(xì)胞、口唇表皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和睪丸原代細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS分別清洗細(xì)胞3次，加入300 μL ORFV FX株病毒液，另設(shè)相應(yīng)對照孔細(xì)胞，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60 min后，補充20 g/L MEM至1 mL，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后，在倒置顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 羊口瘡病毒PCR檢測方法 根據(jù)NCBI中收錄的ORFV/Shanxi/2011/China參考毒株B2L全基因序列(GenBank號為：JN565696.1)，通過Primer 5.0設(shè)計ORFV B2L基因引物(表1)。引物由Invitrogen公司合成。

表1 用于擴(kuò)增羊口瘡病毒B2L基因的引物

取200 μL凍融3次后ORFV細(xì)胞病毒液，加入800 μL Lysis buffer，室溫靜置10 min，加入1.0 mL冷凍的異丙醇，-20 ℃放置5 min，14 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 700 mL/L乙醇洗滌，14 000 r/min離心10 min，棄去乙醇晾干后，加入10 μL無菌ddH2O溶解DNA，用于PCR。PCR體系(25 μL)：2×TaqMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模版5 μL，ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。配制20 g/L瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR產(chǎn)物電壓100 V電泳40 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 病毒TCID50測定 取96孔板中羔羊腎外膜上皮細(xì)胞、口唇表皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和睪丸原代細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS分別清洗細(xì)胞3次。將ORFV FX株病毒液用20 g/L MEM 通過10倍倍比梯度稀釋，同時設(shè)定20 g/L MEM維持液為陰性對照和未稀釋的病毒液為陽性對照，每孔加入100 μL，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，補加100 μL維持液。每隔12 h觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄細(xì)胞病變結(jié)果。按照Reed-Muench方法計算病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

2 結(jié)果

2.1 羔羊4種組織細(xì)胞培養(yǎng)觀察結(jié)果

腎外膜上皮細(xì)胞和睪丸原代細(xì)胞在復(fù)蘇后培養(yǎng)至第4天，細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶底；口唇表皮細(xì)胞培養(yǎng)至第6天細(xì)胞鋪滿瓶底；肺上皮細(xì)胞在培養(yǎng)至第8天后，細(xì)胞鋪滿瓶底。圖1為羔羊不同組織細(xì)胞傳代后2 d～4 d，細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶底80%的結(jié)果，圖1a為腎外膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞界限清晰，核質(zhì)均勻，呈鋪路石樣；圖1b為口唇表皮細(xì)胞，細(xì)胞界限清晰，有上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞；圖1c為肺上皮細(xì)胞，核質(zhì)清晰；圖1d為睪丸原代細(xì)胞，細(xì)胞界限清晰，200倍鏡下可見核透亮，細(xì)胞呈纖維狀。

A.腎外膜上皮細(xì)胞; B.口唇表皮細(xì)胞; C.肺上皮細(xì)胞; D.睪丸原代細(xì)胞A.Epithelial cells of kidney outer membrane;B.Epidermal cells of lip;C.Lung epithelial cells;D.Testicular primitive cells

2.2 ORFV 在4種組織細(xì)胞上的病變觀察結(jié)果

腎外膜上皮細(xì)胞，培養(yǎng)12 h細(xì)胞核開始濃縮，細(xì)胞質(zhì)顏色加深，細(xì)胞與細(xì)胞之間的界限變得模糊；36 h開始，細(xì)胞逐漸變圓，48 h開始細(xì)胞逐漸脫落(圖2)?？诖奖砥ぜ?xì)胞，12 h細(xì)胞開始收縮變圓，24 h細(xì)胞界限變得模糊，至48 h細(xì)胞收縮成團(tuán)，細(xì)胞脫落明顯(圖3)。肺上皮細(xì)胞，36 h細(xì)胞逐漸脫落，細(xì)胞收縮變形，出現(xiàn)聚團(tuán)(圖4)。睪丸原代細(xì)胞接種ORFV后24 h細(xì)胞邊界變得模糊不清，36 h細(xì)胞核質(zhì)顏色加深，48 h細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞開始大量脫落，至72 h收毒時，70%細(xì)胞變圓，大部分細(xì)胞的細(xì)胞核凝集成一個小團(tuán)，細(xì)胞出現(xiàn)空泡(圖5)。

A.12 h;B.24 h;C.36 h;D.48 h;E.60 h;F.72 h

A.12 h;B.24 h;C.36 h;D.48 h;E.60 h;F.72 h

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A.12 h;B.24 h;C.36 h;D.48 h;E.60 h;F.72 h

2.3 ORFV B2L基因PCR檢測結(jié)果

4種接毒細(xì)胞PCR電泳結(jié)果顯示，4種細(xì)胞的DNA提取物均在500 bp～750 bp之間出現(xiàn)了一條明亮的條帶，結(jié)果與ORFV陽性對照一致，與預(yù)期目的片段大小560 bp結(jié)果相符(圖6)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.口唇表皮細(xì)胞；2.睪丸原代細(xì)胞；3.腎外膜上皮細(xì)胞；4.肺上皮細(xì)胞；5.陽性對照；6.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1.Lip epithelial cell;2.Fetal sheep testicular primitive cell;3.Epithelial cell of kidney outer membrane;4.Lung epithelial cell;5.Positive control;6.Negative control

2.4 ORFV在不同細(xì)胞上感染力的測定

根據(jù)不同稀釋度下每列孔內(nèi)細(xì)胞的病變情況，按Reed-Muench氏法計算，得到ORFV在腎外膜上皮細(xì)胞、口唇表皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、睪丸原代細(xì)胞上的TCID50值分別是10-6.22、10-7.16、10-5.9和10-7.31。

3 討論

迄今為止，人們探討了羊口瘡病毒在多種細(xì)胞上增殖特性。Hessami M等[17]用北美ORFV分離株shoe株接種胎牛脾細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在接種病毒12 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中可檢測到病毒，36 h時，病毒滴度達(dá)到最大值，可達(dá)到1.2×108TCID50/mL。Ouyang P等[18]將ORFV接種到羔羊成纖維細(xì)胞上，觀察到病毒的感染和增殖過程，顯示ORFV的復(fù)制過程大致可以分為4個時期，即病毒進(jìn)入期、隱蔽期、病毒形態(tài)改變與增殖期和釋放期，在接種病毒后的0.5 h～1 h，病毒就能夠成功吸附到細(xì)胞，病毒感染細(xì)胞約0.5 h～5 h后，會通過病毒脫殼和吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在6 h～12 h時病毒的DNA會不斷聚集，可檢測到病毒DNA，但是細(xì)胞的狀態(tài)并沒有變化，15 h～18h，病毒會在細(xì)胞內(nèi)不斷增殖，并從感染的細(xì)胞中增殖釋放，同時也在感染著新的細(xì)胞，使得病變在不斷地擴(kuò)大，最終可以達(dá)到一個穩(wěn)定期，最后能夠檢測到病毒釋放到細(xì)胞外。

本研究中，通過觀察細(xì)胞病變過程，發(fā)現(xiàn)不同組織細(xì)胞在進(jìn)入各個時期的時間是不同的。羊唇表皮細(xì)胞和羊睪丸原代細(xì)胞最早進(jìn)入病毒增殖期，病變出現(xiàn)最早。不同細(xì)胞的生長狀態(tài)及細(xì)胞生長的最適條件也有所不同，羊肺上皮細(xì)胞增殖速度最慢，細(xì)胞復(fù)蘇后第8天才鋪滿細(xì)胞瓶底，而增殖速度較快的腎外膜上皮細(xì)胞、睪丸原代細(xì)胞在復(fù)蘇后培養(yǎng)至第4天即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。剛復(fù)蘇的細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)定，在調(diào)整細(xì)胞至最佳狀態(tài)時才能對細(xì)胞進(jìn)行病毒接種。并且，羊口瘡病毒在這4種細(xì)胞的增殖速度也存在差異，這從其TCID50值就可以得到反映。

本研究證明了腎外膜上皮細(xì)胞、口唇表皮細(xì)胞、睪丸原代細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞這4種原代細(xì)胞在ORFV作用下均能產(chǎn)生病變。ORFV在腎外膜上皮細(xì)胞、唇表皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和睪丸原代細(xì)胞上的TCID50值分別是10-6.22、10-7.16、10-5.9、10-7.31，這表明ORFV對4種細(xì)胞的感染力由大到小分別是睪丸原代細(xì)胞、口唇表皮細(xì)胞、腎外膜上皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞?；谝陨显囼灒覀儼l(fā)現(xiàn)在細(xì)胞水平上，ORFV能夠感染以上4種細(xì)胞，這為探究未出現(xiàn)組織學(xué)病變的免疫機理、ORFV的致病性及病原特征提供了參考資料，也為臨床上分離羊口瘡病毒提供了可能的方法。