福建省蛇源裂頭蚴的分子鑒定及遺傳分析

宋肇程，陳育琪，黃瀟航，魏坤亞，張 龍，殷光文，黃志堅(jiān)

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002)

裂頭蚴(Sparganum )為曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴，是曼氏迭宮絳蟲(Spirometramansoni)中絳期的幼蟲，與歐猥迭宮絳蟲(Spirometraerinaceieuropaei)同種異名[1]。曼氏迭宮絳蟲成蟲多寄生于犬、貓等食肉動(dòng)物的小腸內(nèi)[2]。裂頭蚴一般寄生于蛙、蛇、鳥類或一些哺乳類的肌肉、皮下組織或胸腹腔等處。

裂頭蚴在世界分布較廣，歐洲、美洲、澳洲及非洲都有報(bào)道，但在東南亞國(guó)家居多。我國(guó)很多省市有過記載，最多見于南方如湖南、廣西、廣東和福建等[3]。裂頭蚴病是一種重要的人獸共患病，該病呈全球性分布[4]。隨著人們生活水平不斷提高，蛙類、蛇類等特殊食材的需求量也日益增加，這使得其成為了人類感染裂頭蚴病的重要途徑[5]。裂頭蚴通常經(jīng)外傷傷口或消化道感染人體，可能會(huì)寄生于眼部、皮下、內(nèi)臟、乳房、脊髓和大腦等部位[6-7]。由于其在機(jī)體各器官之間移行從而產(chǎn)生機(jī)械或化學(xué)刺激導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心嘔吐、腹部不適、甚至失明等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[8-9]。

福建省蛇類寄生蟲的遺傳分析研究數(shù)據(jù)較少，本試驗(yàn)對(duì)福建省三明市、漳州市及南平市的某蛇場(chǎng)收集到的4條舟山眼鏡蛇、7條王錦蛇及5條滑鼠蛇樣本進(jìn)行檢查，并從其皮下組織包囊中采集得到裂頭蚴蟲體進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定與遺傳分析。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers，ITS)存在于核糖體基因中，在生物進(jìn)化過程中表現(xiàn)出種內(nèi)高度保守，種間有不同程度變異的特性[10]。線粒體基因組是一種細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、缺少重組、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，是寄生蟲遺傳學(xué)鑒定的理想分子標(biāo)記[11-12]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NAD4)基因是線粒體上進(jìn)化速率較快的基因[13]；線粒體細(xì)胞色素C氧化酶第Ⅲ亞基(cytochrome C oxidase 3,COX3)基因比較保守，是研究物種分子系統(tǒng)演化和分類的有效基因[14]。本試驗(yàn)對(duì)所得到的裂頭蚴ITS基因序列、NAD4基因序列以及COX3基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的相應(yīng)序列進(jìn)行比較分析，對(duì)樣品進(jìn)行分子鑒定和分析，為福建省蛇源裂頭蚴的分子鑒定提供科學(xué)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 采自福建省三明市、漳州市和南平市一些蛇場(chǎng)的舟山眼鏡蛇、王錦蛇和滑鼠蛇。

1.2 方法

1.2.1 病原檢查 觀察受檢蛇樣本的健康狀況，檢查其鱗片表皮、皮下組織和肌肉組織是否存在裂頭蚴包囊，對(duì)獲得的裂頭蚴樣本進(jìn)行記錄并計(jì)算感染率。

1.2.2 樣本DNA提取及PCR擴(kuò)增目的片段 將獲得的裂頭蚴使用FastDNA SPIN Kit試劑盒提取蟲體DNA。使用特定引物和擴(kuò)增酶(表1)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增酶Transstart Fastpfu super Mix的反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5min。EasyTaqMix的反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增時(shí)用超純水代替樣本設(shè)陰性對(duì)照，擴(kuò)增結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，于紫外成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。

表1 PCR引物序列和擴(kuò)增酶

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化與測(cè)序分析 使用北京全式金公司膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit，按照操作步驟進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。后連接于pEASY -Blunt Simple載體上轉(zhuǎn)化至Trans I-T1感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增，涂Kana抗性平板培養(yǎng)過夜。在長(zhǎng)出菌落的平板上挑取單個(gè)菌落于Kana抗性LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 h～6 h。將培養(yǎng)好的菌液用EasyTaqMix和M13F/M13R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。挑選陽(yáng)性菌液送至福州鉑尚生物工程技術(shù)公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的相關(guān)裂頭蚴基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并使用DNA Star7.1軟件對(duì)樣本基因序列之間進(jìn)行同源性分析、基因序列堿基成分測(cè)定以及突變位點(diǎn)的測(cè)定。使用MEGA7軟件測(cè)定試驗(yàn)樣品基因序列的遺傳距離，并繪制種系進(jìn)化樹進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 病原檢查結(jié)果

對(duì)獲得的4條舟山眼鏡蛇、7條王錦蛇及5條滑鼠蛇樣本進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)共5條蛇感染裂頭蚴，總感染率為31.25%。分離到裂頭蚴樣本9條，計(jì)算得知感染強(qiáng)度為1.8條/蛇。裂頭蚴均寄生在蛇的皮下組織(圖1)，分離得到的蟲體長(zhǎng)度在1 cm～5 cm，呈乳白色，身體扁平柔軟，有較強(qiáng)的活動(dòng)性和收縮性。每種蛇的感染情況見表2。

表2 福建省養(yǎng)殖蛇類的裂頭蚴感染情況

圖1 分離得到的裂頭蚴蟲體

2.2 目的基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，可見ITS基因序列條帶大小約1 500 bp，1～9號(hào)樣品可以明顯看出擴(kuò)增到ITS基因(圖2)；NAD4基因序列大小約500 bp，1～9號(hào)樣品可以明顯看出擴(kuò)增到NAD4基因(圖3)；COX3基因序列條帶大小約400 bp，1～5號(hào)樣品可以明顯看出擴(kuò)增到COX3基因(圖4)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～4.舟山眼鏡蛇裂頭蚴樣品；5～9.王錦蛇裂頭蚴樣品；10.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 5 000;1-4.Sparganum from Naja atra;5-9.Sparganum from Elaphe carinata;10.Negative control

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～4.舟山眼鏡蛇裂頭蚴樣品；5～9.王錦蛇裂頭蚴樣品；10.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 5 000;1-4.Sparganum from Naja atra;5-9.Sparganum from Elaphe carinata;10.Negative control

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～2.舟山眼鏡蛇裂頭蚴樣品；3～5.王錦蛇裂頭蚴樣品；6.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 5 000;1-2.Sparganum from Naja atra;3-5.Sparganum from Elaphe carinata;10.Negative control

2.3 裂頭蚴基因序列分析

2.3.1 ITS基因序列分析 本試驗(yàn)使用TW81F/AB28引物擴(kuò)增出的目的基因序列包括部分18S rRNA基因，全部的ITS-1基因、5.8S rRNA基因、ITS-2基因以及部分28S rRNA基因，經(jīng)測(cè)序得到的序列全長(zhǎng)為1 360 bp～1 380 bp。根據(jù)譚磊等[8]參考NCBI中其同科的闊節(jié)裂頭絳蟲(Diphyllobothriumlatum序列號(hào)：KF218251.1)的基因組成對(duì)本試驗(yàn)所得裂頭蚴基因序列進(jìn)行具體分區(qū)，得到全部ITS-1基因序列、5.8S基因序列和ITS-2基因序列及部分18S rRNA基因和28S rRNA基因(表3)。本試驗(yàn)僅保留其ITS1和ITS2基因序列對(duì)得到的9條裂頭蚴樣品進(jìn)行同源性分析，同NCBI的GenBank中歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴FJ886747.1(Spirometraerinaceieuropaeiisolate SE2)的ITS基因的生物同源性為95.70%～98.68%，證明本試驗(yàn)獲得的裂頭蚴為歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴(Spirometraerinaceieuropaei)。

表3 本試驗(yàn)所得蛇類裂頭蚴ITS基因序列分區(qū)情況

經(jīng)GenBank檢索有代表性的曼氏疊宮絳蟲屬絳蟲6個(gè)(序列號(hào)：FJ886747.1、FJ886751.1、FJ886746.1、FJ886752.1、HQ228993.1、KC561781.1)，闊節(jié)裂頭絳蟲(序列號(hào)：KF218251.1)、擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(序列號(hào)：AB367793.1)、腦多頭蚴(序列號(hào)：LC271468.1)、犬復(fù)孔絳蟲(序列號(hào)：AM491338.1)、細(xì)粒棘球絳蟲(序列號(hào)：ITS-1：KJ363922.1；ITS-2： KR872308.1)以及作為外群的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(序列號(hào)：ITS-1：KC998766.1；ITS-2：LC360163.1)各1個(gè)，將其ITS1和ITS2基因序列與本試驗(yàn)所得裂頭蚴ITS1與ITS2序列應(yīng)用DNA Star7.1軟件的Megalign程序進(jìn)行同源性分析，可以看出各個(gè)序列之間的同源性與差異性的百分比(圖5)。本試驗(yàn)所得裂頭蚴ITS序列與GenBank中歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴之間序列同源性為95.9%～99.8%；與其他絳蟲同源性低于77.9%，同時(shí)本試驗(yàn)所得各蟲體的ITS基因之間同源性為98.9%～100%，同源性較高。

圖5 ITS基因序列同源性性對(duì)比

從堿基組成角度來(lái)看，本試驗(yàn)得到的裂頭蚴ITS1基因的A、T、C、G堿基的平均含量為15.63%、30.83%、22.88%、30.62%。ITS2基因的A、T、C、G堿基的平均含量為13.62%、32.29%、22.93%、31.19%。經(jīng)DNA Star7.1軟件分析可知裂頭蚴樣本ITS基因序列同已知參考序列FJ886747.1(Spirometraerinaceieuropaeiisolate SE2)對(duì)比，存在的堿基點(diǎn)突變數(shù)平均為6.11，堿基缺失數(shù)平均為21.44，堿基插入數(shù)平均為9.89。使用MEGA7對(duì)所得序列進(jìn)行遺傳距離的計(jì)算可知，本試驗(yàn)樣本之間的遺傳距離為0～0.004 1，平均遺傳距離為0.001 6，與已知參考序列的遺傳距離為0.003 0～0.004 3，與其他絳蟲遺傳距離大于0.016 3(表4)。

表4 本試驗(yàn)所得蛇類裂頭蚴ITS基因序列突變情況

2.3.2 NAD4基因序列分析 經(jīng)測(cè)序得到裂頭蚴的NAD4序列全長(zhǎng)在356 bp～650 bp，與NCBI GenBank中HM475076.1歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴的同源性為96.73%～100%。由此可證明本試驗(yàn)獲得的裂頭蚴為歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴(Spirometraerinaceieuropaei)。經(jīng)GenBank檢索有代表性的7個(gè)歐猥疊宮絳蟲屬絳蟲(序列號(hào)：HM475076.1、KF745185.1、KF745179.1、HM475083.1、HM475094.1、KF656763.1、HM475079.1)、細(xì)粒棘球絳蟲(序列號(hào)：41697831)和擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(序列號(hào)：34926715)的NAD4基因序列，與本試驗(yàn)所得序列應(yīng)用DNA Star7.1軟件的Megalign程序進(jìn)行同源性分析，可以看出各個(gè)序列之間的同源性與差異性的百分比(圖6)。本試驗(yàn)所得裂頭蚴NAD4序列與GenBank中歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴之間序列同源性為89.1%～100%，與其他絳蟲同源性小于70.2%；且本試驗(yàn)得到的各蟲體的NAD4基因之間的同源性為93.0%～100%，有一定的差異性。

圖6 NAD4基因序列同源性性對(duì)比

從堿基組成角度來(lái)看，本試驗(yàn)得到的裂頭蚴NAD4基因的A、T、C、G堿基的平均含量為16.30%、47.93%、13.03%、22.71%。經(jīng)DNA Star7.1軟件分析可知裂頭蚴樣本NAD4基因序列同已知參考序列HM475076.1對(duì)比，存在的堿基點(diǎn)突變數(shù)平均在15.67，堿基缺失數(shù)平均為0，堿基插入數(shù)平均為0。使用MEGA7對(duì)所得序列進(jìn)行遺傳距離的計(jì)算可知，本試驗(yàn)樣本之間的遺傳距離為0～0.010 1，平均遺傳距離為0.004 1，與已知參考序列的遺傳距離為0～0.011 6，與其他絳蟲遺傳距離大于0.023 3(表5)。

表5 本試驗(yàn)所得蛇類裂頭蚴NAD4基因序列突變情況

2.3.3 COX3基因序列分析 經(jīng)測(cè)序得到裂頭蚴的COX3序列全長(zhǎng)為379 bp～408 bp，與NCBI GenBank中HM475033.1歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴的同源性為98.94%～100%。由此可證明本試驗(yàn)獲得的裂頭蚴為歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴(Spirometraerinaceieuropaei)。經(jīng)GenBank檢索有代表性的6個(gè)歐猥疊宮絳蟲屬絳蟲(序列號(hào)：HM475033.1、HM475029.1、KF745159.1、KF745165.1、HM475037.1、HM475038.1)、細(xì)粒棘球絳蟲(序列號(hào)：41697846)和擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(序列號(hào)：34926731)的COX3基因序列，與本試驗(yàn)所得序列應(yīng)用DNA Star7.1軟件的Megalign程序進(jìn)行同源性分析，可以看出各個(gè)序列之間的同源性與差異性的百分比(圖7)。本試驗(yàn)所得裂頭蚴COX3序列與GenBank中歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴之間序列同源性為96.7%～100%，與其他絳蟲同源性小于64.5%；且本試驗(yàn)得到的各蟲體的COX3基因同源性為96.8%～100%，存在一定的差異性。

圖7 COX3基因序列同源性性對(duì)比

從堿基組成角度來(lái)看，本試驗(yàn)得到的裂頭蚴COX3基因的A、T、C、G堿基的平均含量為17.56%、47.96%、11.20%和23.28%。軟件分析可知裂頭蚴樣本COX3基因序列同已知參考序列HM475033.1對(duì)比，存在的堿基點(diǎn)突變數(shù)平均為5.20，堿基缺失數(shù)平均為0，堿基插入數(shù)平均為0。使用MEGA7對(duì)所得序列進(jìn)行遺傳距離的計(jì)算可知，本試驗(yàn)樣本之間的遺傳距離為0～0.009 0，平均遺傳距離為0.003 8，與已知參考序列的遺傳距離為0.002 5～0.007 0，與其他絳蟲遺傳距離大于0.029 1(表6)。

表6 本試驗(yàn)所得蛇類裂頭蚴COX3基因序列突變情況

2.3.4 系統(tǒng)發(fā)生樹分析 選取本試驗(yàn)所得3種基因序列使用MEGA7.0軟件的NJ法繪制序列系統(tǒng)發(fā)生樹。通過種系發(fā)育分析顯示，本試驗(yàn)所得歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴ITS基因序列有較高的同源性，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的FJ886747.1(Spirometraerinaceieuropaeiisolate SE2)、FJ886752.1 (Spirometraerinaceieuropaeiisolate SE7)和HQ228993.1(Spirometrasp.JL-2010)同屬于一個(gè)分支。舟山眼鏡蛇4號(hào)裂頭蚴樣品與王錦蛇3號(hào)、4號(hào)裂頭蚴樣品與HQ228993.1和FJ886752.1親緣關(guān)系較近，其余樣品與FJ886747.1親緣關(guān)系較近。本試驗(yàn)所得所有裂頭蚴樣品親緣關(guān)系與同科的闊節(jié)裂頭絳蟲KF218251.1親緣關(guān)系較近而與其他絳蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖8)。

圖8 裂頭蚴ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

本試驗(yàn)所得歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴NAD4基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴NAD4基因序列屬于同一大分支，但三明株舟山眼鏡蛇裂頭蚴與HM475076.1、KF745185.1和KF745179.1親緣關(guān)系更近；而漳州株王錦蛇裂頭蚴與HM475083.1和HM475094.1親緣關(guān)系更近；試驗(yàn)所得歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴與其他絳蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖9)。本試驗(yàn)所得歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴COX3基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴COX3基因序列屬于同一大分支，三明株舟山眼鏡蛇裂頭蚴與 KF745165.1、HM475033.1、HM475029.1和KF745159.1親緣關(guān)系更近；而漳州株王錦蛇裂頭蚴與HM475037.1和HM475038.1親緣關(guān)系更近；試驗(yàn)所得歐猥迭宮絳蟲裂頭蚴與其他絳蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖10)。

圖9 裂頭蚴NAD4基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

圖10 裂頭蚴COX3基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討論

自1999年以來(lái)，我國(guó)是世界上發(fā)生裂頭蚴病病例最多的國(guó)家，在34個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)中，有27個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)共報(bào)告了近1 000例人類裂頭蚴病病例[15]。裂頭蚴病對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，也會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究野生動(dòng)物體內(nèi)的裂頭蚴自然感染和系統(tǒng)發(fā)育，對(duì)于預(yù)防和控制裂頭蚴病，了解寄生蟲的序列變異和遺傳結(jié)構(gòu)具有重要意義[16]。福建省蛇類寄生蟲的遺傳分析研究數(shù)據(jù)基本屬于空白，本試驗(yàn)通過在福建省三明市、漳州市和南平市某些蛇場(chǎng)進(jìn)行采樣，得到了一些寄生在蛇體內(nèi)的裂頭蚴樣本并對(duì)其進(jìn)行研究分析。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和PCR技術(shù)的成熟，這些技術(shù)為寄生蟲的分子生物學(xué)鑒定和分類提供了基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的以形態(tài)學(xué)為主要依據(jù)的鑒定方式具有一定的局限性，所以通過分子生物學(xué)手段進(jìn)行物種鑒定則顯得尤為重要。ITS基因是核糖體DNA (rDNA)中介于18S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括ITS-1和ITS-2兩段序列，種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異[17]。本試驗(yàn)對(duì)裂頭蚴樣品的ITS基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序得到序列與NCBI Blast公布的序列比對(duì)，結(jié)果表明該樣品為歐猥迭宮裂頭蚴(Spirometraerinaceieuropaei)，且與NCBI中公布的歐猥迭宮裂頭蚴ITS序列的同源性均高于95.90%,而與其他絳蟲的同源性均低于77.9%。本試驗(yàn)裂頭蚴樣本之間的遺傳距離為0～0.004 1，平均遺傳距離為0.001 6，與已知參考序列的遺傳距離為0.003 0～0.004 3，與其他絳蟲遺傳距離大于0.016 3。從而顯示利用ITS基因可以使歐猥迭宮裂頭蚴與其他得到很好的鑒別。譚磊等[8]曾對(duì)湖南省黑斑蛙裂頭蚴進(jìn)行ITS基因擴(kuò)增，得到的ITS1和ITS2基因序列長(zhǎng)度分別為611 bp～689 bp和490 bp～502 bp，樣本之間同源率分別為95.4%和94.6%，與其研究相比，本試驗(yàn)ITS2基因序列略短一些，但I(xiàn)TS基因序列整體同源率更高，可見福建株蛇源裂頭蚴ITS基因序列保守性較湖南株更高。本試驗(yàn)得到的ITS基因序列存在著少量的點(diǎn)突變，但卻有較多堿基缺失和插入的情況，個(gè)體之間存在著一些差異，而18S、5.8S和28S則種內(nèi)相對(duì)保守，所以ITS基因作為物種種內(nèi)鑒定的分子標(biāo)記相對(duì)具有優(yōu)勢(shì)。線粒體是真核細(xì)胞的一種細(xì)胞器，它有擁自己的基因組，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、缺少重組、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，是對(duì)物種進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定的理想分子標(biāo)記。所以本試驗(yàn)對(duì)裂頭蚴線粒體NAD4基因和COX3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與NCBI GenBank公布的歐猥迭宮裂頭蚴序列比對(duì)。試驗(yàn)樣本NAD4基因與參考序列的同源性為89.1%～100%，與其他絳蟲同源性小于70.2%。樣本之間的遺傳距離為0～0.010 1，平均遺傳距離為0.004 1，與已知參考序列的遺傳距離為0～0.011 6，與其他絳蟲遺傳距離大于0.023 3。試驗(yàn)樣本COX3基因與參考序列的同源性為96.7%～100%，與其他絳蟲同源性小于64.5%。樣本之間的遺傳距離為0～0.009 0，平均遺傳距離為0.003 8，與已知參考序列的遺傳距離為0.002 5～0.007 0，與其他絳蟲遺傳距離大于0.029 1。伍慧蘭[11-12]曾對(duì)湖南省黑斑蛙裂頭蚴進(jìn)行NAD4和COX3基因擴(kuò)增，得到NAD4基因序列長(zhǎng)度為640 bp，變異率在2.3%～2.5%；COX3基因長(zhǎng)度為264 bp，樣本間同源率高于98%，與其研究相比，本試驗(yàn)的得到的COX3基因序列較長(zhǎng)，且本試驗(yàn)得到的NAD4和COX3基因同源率略低，可見福建株蛇源裂頭蚴NAD4和COX3基因序列保守性較湖南株略低。從總體來(lái)看本試驗(yàn)得到的裂頭蚴NAD4和COX3基因雖然沒有堿基缺失和插入的情況，但是個(gè)別個(gè)體堿基突變較多。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，COX3基因比NAD4基因更加保守，雖然個(gè)別個(gè)體的基因序列存在較多的突變情況但是仍然可以將歐猥迭宮絳蟲與其他絳蟲進(jìn)行區(qū)分，并且從進(jìn)化樹分析來(lái)看，本試驗(yàn)獲得的三明株和漳州株的裂頭蚴NAD4和COX3基因在進(jìn)化樹同一大分支上存在著不同的分化，由此可見NAD4和COX3基因在物種的地域性鑒別上有一定的優(yōu)勢(shì)。

通過對(duì)裂頭蚴已有的生活史研究進(jìn)行分析，本試驗(yàn)所采樣的飼養(yǎng)場(chǎng)在蛇類幼年期都存在使用蛙類給蛇作為開口飼料的情況，而蛙類飼料有些是通過抓捕的野生蛙獲得的。養(yǎng)殖蛇類有極大可能通過采食感染了裂頭蚴的野生蛙繼而感染裂頭蚴。如果人類對(duì)寄生有裂頭蚴的蛇肉處理不當(dāng)并食用，便有極大的可能感染裂頭蚴，從而對(duì)身體健康造成極大的危害。因此，防控養(yǎng)殖動(dòng)物的裂頭蚴感染刻不容緩，提醒養(yǎng)殖戶對(duì)養(yǎng)殖蛇類的飼料進(jìn)行把控，切斷裂頭蚴的傳播途徑，以保證蛇肉的食品安全。由于野生蛇類的裂頭蚴感染可能會(huì)更加嚴(yán)重，所以同時(shí)提醒對(duì)蛇肉有偏好的消費(fèi)者選擇正規(guī)養(yǎng)殖場(chǎng)的健康蛇類并且食用時(shí)做好處理，拒絕食用野生蛇類。本試驗(yàn)所得結(jié)果為福建省舟山眼鏡蛇裂頭蚴的分子生物學(xué)研究提供了依據(jù)，為以后福建省蛇源裂頭蚴的分子流行病學(xué)調(diào)查及種群遺傳學(xué)等更深入的研究奠定了基礎(chǔ)。