成都市貓諾如病毒的檢測(cè)及VP1基因序列分析

黃思琦，黃 堅(jiān)，楊曉農(nóng)，郭 琪，李 妍

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041)

貓諾如病毒(Feline norovirus, FNoV)屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)諾如病毒屬(Norovirus)，為無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]。基因組全長(zhǎng)約7.5 kb，含有編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)和結(jié)構(gòu)蛋白(VP)的3個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames，ORFs)[2]。ORF1編碼6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，其中RNA聚合酶區(qū)域在杯狀病毒科中高度保守，為檢測(cè)常用的靶基因。ORF2編碼分子質(zhì)量約57 ku的病毒主要衣殼蛋白VP1，該蛋白能自動(dòng)裝配并形成病毒衣殼，根據(jù)其序列同源性差異可將諾如病毒分為7個(gè)基因群[3-4]。其中貓諾如病毒分為GⅣ基因群與GⅥ基因群，在美國(guó)和巴西已檢測(cè)出GⅣ基因群[5-6]，在意大利則為GⅥ基因群[7]，日本報(bào)道同時(shí)存在GⅣ和GⅥ基因群[8-9]。諾如病毒可感染人、貓、犬、豬、牛、獅子等多種動(dòng)物[10-12]，主要經(jīng)消化道途徑傳播，以幼齡和老齡者最為易感。人類(lèi)的非細(xì)菌性胃腸炎中，50%以上是由諾如病毒感染導(dǎo)致的[2]。

自2010年美國(guó)首次從貓腹瀉樣本中檢測(cè)出FNoV[5]，隨后在日本[8-9]、巴西[6]、意大利[7]的貓腹瀉樣本中也相繼檢出。目前文獻(xiàn)報(bào)道用于檢測(cè)FNoV的PCR引物有3對(duì)，均針對(duì)病毒保守的RNA聚合酶3'端區(qū)域。其中廣泛性引物p289d-p290d為最早建立的檢測(cè)杯狀病毒科的引物[13]，用于不同物種的諾如病毒的檢測(cè)[7-8,14]，該引物被多次用于不同國(guó)家貓腹瀉樣本中FNoV的檢測(cè)[5-9]。引物JV12Y/13I為檢測(cè)諾如病毒的特異性引物[15]，有研究將其與引物p289d-p290d聯(lián)合用于FNoV檢測(cè)[7]。引物FNoV-F9/R15是基于FNoV序列而設(shè)計(jì)的特異性引物[5]，有研究表明使用該引物的檢出率(6/14)高于使用廣泛性引物p289d-p290d的檢出率(3/14)?？梢?jiàn)，使用不同檢測(cè)引物的檢測(cè)靈敏度存在差異。目前國(guó)內(nèi)尚未有FNoV流行情況的報(bào)道，而基于已有的FNoV分子檢測(cè)方法的敏感性比較研究也并不完整，為此筆者選用文獻(xiàn)報(bào)道的3對(duì)FNoV檢測(cè)引物對(duì)成都市貓群的糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)和復(fù)核，擬篩選出最適合的FNoV檢測(cè)引物，并初步掌握成都市FNoV的流行情況和流行毒株的分子特征，為FNoV的持續(xù)監(jiān)測(cè)及進(jìn)一步防控提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病例 于2019年8月-12月自四川成都市區(qū)5家動(dòng)物醫(yī)院收集的127例貓糞便樣本，其中腹瀉樣本71例(公貓占50.7%，母貓占49.3%；小于1歲齡占88.7%，不低于1歲齡占11.3%)，正常糞便樣本56例(公貓占58.1%，母貓占41.9%；小于1歲齡占85.7%，不低于1歲齡占14.3%)。

1.1.2 主要試劑 Trizol、氯仿、異丙醇、冰乙醇、DEPC水、大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ、DNA標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；RNAiso Plus(Total RNA 提取試劑)、pMD19-T載體、Prime ScriptTMRT、PrimixTaqTM試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，Omega公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱及恒溫振蕩培養(yǎng)箱，Thermoforma公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋(YZB)，諸城安泰機(jī)械有限公司產(chǎn)品；旋渦儀，上海青浦滬西儀器廠產(chǎn)品； VersaDoc2000凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀(CFX96)、Powerpac universalTM核酸蛋白電泳儀，Bio-Rad(美國(guó))公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)(5804)，Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物信息 本研究合成了文獻(xiàn)報(bào)道的3對(duì)檢測(cè)引物，p289d-p290d[13]為針對(duì)杯狀病毒科的廣泛反應(yīng)性引物，JV12Y/13I[15]為檢測(cè)諾如病毒的引物，F(xiàn)NoV-F9/R15[5]為針對(duì)貓諾如病毒的檢測(cè)引物,引物信息見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

同時(shí)合成特異性引物用于檢測(cè)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(FPV)、貓星狀病毒(Feline astrovirus,FAstV)和貓腸道冠狀病毒(Feline coronavirus,FECoV)。FPV VP2(F:GGATGGGTGGAAATCACAGC; R: ATAACCAACCTCAGCTGGTC; 退火溫度46 ℃)[16]；FAstV ORF1b(F:CTGGAAGAGCTATGACACCATTG; R:CCATGAACGCAGAGAGCAAC;退火溫度56 ℃)[17]；FECoV N(F:GACGCGTTGTCCCTGTGTGTG; R:TCAATCTAGAGGAAGACACC;退火溫度52 ℃)[18]。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及總RNA提取 將采集到的病料在24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用1 000 μg/mL～2 000 μg/mL雙抗+PBS，分裝EP管，于-80 ℃反復(fù)凍融3次，5 000 r/min，離心8 min后，取300 μL上清液，采用Trizol法提取RNA，加入Trizol裂解液700 μL，劇烈混勻，室溫靜置5 min。加入200 μL氯仿，渦旋后室溫下靜置10 min。12 000 r/min、4 ℃離心15 min；取上清，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄掉上清，加入1 mL 750 mL/L DEPC乙醇，洗滌RNA沉淀及管壁，彈起沉淀物，渦旋，12 000 r/min、4 ℃離心10 min。棄去EP管中液體，晾干后加入20 μL DEPC水溶解，置冰上。

1.2.2 cDNA合成 采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取好的RNA樣本按照Prime ScriptTMRT Reagent Kit說(shuō)明書(shū)的方法配制反應(yīng)體系，將1.2.1提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，含5 ×Prime Script buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL、Random 6 mers 2 μL、RNA 4 μL、RNAase Free dH2O 9 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，15 s；16 ℃，10 min，取出cDNA置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) 利用合成的3對(duì)檢測(cè)引物分別以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同引物退火溫度設(shè)置不同。反應(yīng)體系為20 μL(2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；49 ℃/50 ℃/57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否出現(xiàn)特異大小的條帶，并送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 PCR方法擴(kuò)增VP1基因片段 設(shè)計(jì)3對(duì)引物擴(kuò)增VP1基因片段，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度見(jiàn)表2，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表2 PCR擴(kuò)增VP1所用引物序列信息

1.2.5 VP1序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將1.2.4的PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的片段，將其克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果拼接成完整的VP1核酸序列，與GenBank上的諾如病毒代表毒株的VP1序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS22.0,采用卡方檢驗(yàn)(2)分析樣本間的差異顯著性，并進(jìn)行方差分析和多重比較，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 采用不同引物擴(kuò)增的檢出率對(duì)比及臨床樣本檢測(cè)

受檢貓群中FNoV的檢出率為9.45%(12/127)，其中臨床腹瀉樣本中的檢出率為11.26%(8/71)，臨床健康樣本中的檢出率為7.14%(4/56)。使用文獻(xiàn)報(bào)道的3對(duì)引物同時(shí)對(duì)127例貓糞便樣本(含臨床腹瀉樣本71例，臨床健康樣本56例)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示使用廣泛性引物p289d-p290d檢出3例陽(yáng)性樣品(SMU-SC-CHN1/2019、SMU-SC-CHN2/2019與SMU-SC-CHN3/2019，均來(lái)自臨床腹瀉樣本)，采用諾如病毒的特異性引物JV12Y/13I檢出1例陽(yáng)性樣品(SMU-SC-CHN5/2019，為臨床腹瀉樣本)，使用貓諾如病毒的特異性引物FNoV-F9/R15檢出12例陽(yáng)性樣品(8例來(lái)自臨床腹瀉樣本，4例來(lái)自臨床健康樣本)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。使用引物FNoV-F9/R15的檢出率(9.45%，12/127)高于使用引物p289d-p290d(2.36%，3/127)與引物JV12Y/13I(0.79%，1/127)的檢出率。表3的結(jié)果顯示，12例陽(yáng)性樣品均來(lái)源于小于1歲齡的幼貓，無(wú)性別和臨床癥狀差異。臨床腹瀉樣本或臨床健康樣本中4例為FNoV/FPV混合感染，3例為FNoV/FECoV混合感染，2例為FNoV/FECoV/FAstV混合感染，1例為FNoV/FPV/FECoV混合感染，1例FNoV/FECoV/FAstV/FPV混合感染，1例為單一FNoV陽(yáng)性。

表3 FNoV陽(yáng)性樣品的信息列表

A.p289d-p290d;B.JV12Y/13I;C.FNoV-F9/R15;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～12.臨床樣品；13.陰性對(duì)照A.p289d-p290d;B.JV12Y/13I;C.FNoV-F9/R15;M.DNA Marker DL 2 000;1-12.Clinical samples;13.Negative control

使用3對(duì)引物對(duì)臨床樣品的檢出率差異較大，將引物分別與GenBank上貓諾如病毒美國(guó)毒株(GⅣ.2，GenBank登錄號(hào)：JF781268)、日本毒株(GⅣ.2，GenBank登錄號(hào)：LC389583；GⅥ.1，GenBank登錄號(hào)：LC011951)、意大利毒株(GVI.2，GenBank登錄號(hào)：KT245136)、巴西毒株(GenBank登錄號(hào)：KM505133)的基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)引物JV12Y/13I、引物p289d-p290d均存在較多堿基無(wú)法與病毒序列匹配；而引物FNoV-F9/R15為3對(duì)引物中與病毒序列匹配度最高的引物，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2。引物與病毒序列不匹配出現(xiàn)在3'末端會(huì)影響引物的擴(kuò)增效率。使用Oligo 7.0分析顯示引物JV12Y/13I的G/C含量偏低，且Tm值較低；引物p289d-p290d的3'端存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)且G/C含量偏低。從127例臨床糞便樣的檢測(cè)對(duì)比結(jié)果顯示，F(xiàn)NoV-F9/R15為3對(duì)引物中最適于臨床檢測(cè)擴(kuò)增貓諾如病毒。

圖2 3對(duì)引物與貓諾如病毒序列比對(duì)

將使用引物FNoV-F9/R15檢出的12例陽(yáng)性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank上的諾如病毒代表毒株的RNA聚合酶編碼區(qū)基因進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示這12株臨床樣本間的核苷酸同源性為90.0%～100%。經(jīng)MEGA7.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示(圖3)，12株臨床樣本均位于遺傳進(jìn)化樹(shù)上貓科動(dòng)物諾如病毒大分支中，與日本、美國(guó)、意大利、巴西的貓諾如病毒和意大利獅子諾如病毒匯聚在一起，從而確證這些臨床樣本中均存在FNoV。其中11個(gè)臨床毒株與日本FNoV毒株M81(GIV.2，GenBank登錄號(hào)：LC389583)親緣關(guān)系最近，核苷酸同源性為90.0%～95.7%；而臨床腹瀉樣本毒株CHN9與意大利毒株77-13(GVI.2，GenBank登錄號(hào)：KT245136)同源性較高，為92.6%。12株臨床毒株與犬諾如病毒(GIV.2)核苷酸同源性為80.9%～81.7%，而與人諾如病毒(GIV.1)核苷酸同源性為71.7%～74.8%。

2.2 VP1的擴(kuò)增及序列分析

使用擴(kuò)增VP1全基因序列的3對(duì)引物對(duì)12份陽(yáng)性樣本進(jìn)行擴(kuò)增，成功拼接獲得了7株毒株的VP1全長(zhǎng)基因序列(GenBank登錄號(hào)：MT256404-256410)，序列長(zhǎng)度為1 737 bp。測(cè)序結(jié)果分析表明，這7株FNoV的VP1核苷酸序列間同源性為89.0%～100%，氨基酸序列同源性為96.5%～100%。經(jīng)MEGA7.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示(圖4)，F(xiàn)NoV分為GⅣ基因群和GⅥ基因群，7株臨床毒株均分布于GⅣ基因群中的基因2型(GⅣ.2)的分支上，與美國(guó)毒株(GenBank登錄號(hào)：JF781268)和日本毒株M81(GenBank登錄號(hào)：LC389583)親緣關(guān)系近。其中CHN1、CHN5、CHN6臨床毒株與美國(guó)毒株親緣關(guān)系最近，核苷酸同源性為95.2%～95.6%，氨基酸同源性為98.2%～98.4%。CHN10臨床毒株(臨床健康樣品)則與日本毒株M81位于同一小分支，核苷酸同源性為96.7%，氨基酸同源性為98.9%。而CHN2、CHN3、CHN4臨床毒株則聚為獨(dú)立的一小分支。在諾如病毒GIV基因群中還包括犬諾如病毒及人諾如病毒，分析顯示這7株臨床毒株與犬諾如病毒(GⅣ.2)核苷酸同源性為82.1%～82.7%，氨基酸同源性為90.5%～91.2%；與人諾如病毒(GⅣ.1)核苷酸同源性為66.7%～67.5%，氨基酸同源性為69.1%～70.6%。對(duì)推導(dǎo)的VP1蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，CHN2、CHN3、CHN4臨床毒株上存在不同于GⅣ.2基因型其他FNoV毒株(日本、美國(guó)毒株及CHN1、CHN5、CHN6、CHN10臨床毒株)的11個(gè)共有氨基酸變異位點(diǎn)，分別位于VP1蛋白的S區(qū)(3個(gè))、P1區(qū)(4個(gè))及P2區(qū)(4個(gè))。其中P1區(qū)271位氨基酸，P2區(qū)385位、427位、428位氨基酸存在極性或酸堿性變異?；赩P1基因序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，成都地區(qū)流行的FNoV毒株均為GⅣ基因群中的基因2型(GⅣ.2)，且病毒在不斷變異，已呈現(xiàn)共有的氨基酸變異位點(diǎn)。

●臨床腹瀉樣本；○臨床健康樣本●Clinical diarrhea samples;○Clinical healthy samples

3 討論

對(duì)成都市127例貓糞便樣本的檢測(cè)結(jié)果提示，引物FNoV-F9/R15為目前最適于臨床檢測(cè)FNoV核酸的RT-PCR引物。雖然3對(duì)引物均是對(duì)病毒RNA聚合酶保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，但引物FNoV-F9/R15是根據(jù)貓諾如病毒基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物[5]，序列比對(duì)結(jié)果也顯示其與不同基因型的FNoV序列具有較高的匹配度，這十分有利于引物退火后順利進(jìn)行延伸和擴(kuò)增。而另外2對(duì)引物可用于檢測(cè)多個(gè)物種的諾如病毒，因此與FNoV序列的匹配差異也體現(xiàn)出毒株的種屬差別，此外引物分析結(jié)果也證實(shí)了這2對(duì)引物存在GC含量低、Tm值偏低、3'端發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及3'端自由能偏低等問(wèn)題，可能也是導(dǎo)致二者檢出率低的原因。在一項(xiàng)關(guān)于犬諾如病毒(CNoV)的檢測(cè)報(bào)道中，研究人員也證實(shí)了使用針對(duì)CNoV的特異性引物的檢出率(27.6%，29/105)遠(yuǎn)高于使用引物JV12Y/13I(1.9%，2/105)及引物p289d-p290d(0%，0/105)[14]的檢出率。因此，在選擇或設(shè)計(jì)檢測(cè)引物時(shí)應(yīng)充分考慮病原的種屬特異性，從而提高真實(shí)檢出率，避免漏檢。

在過(guò)往的若干報(bào)道中，研究人員僅從臨床腹瀉樣品中檢出了FNoV[5-9]，而作者從腹瀉和臨床健康樣本中均檢出了FNoV，提示臨床健康貓可攜帶FNoV。已有的報(bào)道證實(shí)FNoV具有致病性，將FNoV(M49-1，GⅥ.1)毒株接種2月齡～3月齡SPF貓，能引起貓腹瀉，并且能從血清及腹瀉樣本中檢出病毒核酸[9]。但不同基因型的病毒其致病力存在差異[10]，本研究獲得的FNoV流行株均為GⅣ.2基因型，并且存在于其他貓腸道病毒混合感染的情況。我們前期的相關(guān)研究結(jié)果提示[17]，貓攜帶多種病毒性腸道病原可能是普遍現(xiàn)象，當(dāng)環(huán)境改變、機(jī)體免疫力下降及其他病原感染并存時(shí)，病毒可加快復(fù)制從而導(dǎo)致相關(guān)消化道癥狀，因此該基因型毒株是否具有單獨(dú)致病性仍需進(jìn)一步研究。

VP1序列分析結(jié)果顯示，成都市的FNoV與美國(guó)和日本的GⅣ.2毒株親緣關(guān)系較近，推測(cè)可能是通過(guò)品種貓的引種繁殖使FNoV在國(guó)內(nèi)傳播。有趣的是，臨床毒株CHN2、CHN3、CHN4的VP1蛋白序列出現(xiàn)了11個(gè)不同于FNoV其他GⅣ.2毒株的共有氨基酸變異位點(diǎn)，這些位點(diǎn)所在的P1-P2區(qū)為諾如病毒的免疫識(shí)別和細(xì)胞黏附的關(guān)鍵區(qū)域[19]。已有的研究表明，人諾如病毒GⅡ.4的P2區(qū)域變異易產(chǎn)生抗原漂移導(dǎo)致免疫逃避，從而產(chǎn)生新的流行毒株[20]，而臨床FNoV毒株出現(xiàn)的VP1蛋白的變異，特別是在P1區(qū)(4個(gè))及P2區(qū)(4個(gè))的共有氨基酸變異是否具有相似作用仍需要進(jìn)行深入研究。

目前尚無(wú)直接證據(jù)表明貓諾如病毒可以跨種間傳播，但從英國(guó)、巴西、西班牙和葡萄牙采集的臨床寵物醫(yī)生的血清樣本檢測(cè)出犬諾如病毒GⅥ抗體(22.3%，83/373)，而非臨床寵物醫(yī)生的血清樣本抗體檢出率僅為5.8%(7/120)[21]。另外一項(xiàng)研究也表明，92份主人表現(xiàn)胃腸道癥狀的犬糞便樣本中檢測(cè)了出4份人諾如病毒GⅡ[22]。雖然我們沒(méi)有進(jìn)行FNoV的抗體血清學(xué)調(diào)查，但可以推測(cè)的是，在貓與人類(lèi)密切接觸的共居環(huán)境中，貓與人的諾如病毒可能會(huì)發(fā)生交叉感染以及引發(fā)相關(guān)疾病，需要引起持續(xù)關(guān)注。