1例B(A)血型鑒定及家系分析

楊 倩，戚 超，徐 婷，姚春艷

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，重慶 400038

ABO血型系統(tǒng)是人類最重要的血型系統(tǒng)，除了A型、B型、O型、AB型這4種常見(jiàn)血型外，還有一些罕見(jiàn)的抗原較弱的亞型，比如B(A)血型[1]。B(A)血型在人群中的出現(xiàn)頻率約為1/50萬(wàn)，該人群血清中存在高度活性的B型糖基轉(zhuǎn)移酶，同時(shí)也存在少量的A型糖基轉(zhuǎn)移酶，因此，其紅細(xì)胞上不僅存在B抗原，還存在很弱的A抗原[2]。B(A)血型被認(rèn)為是遺傳學(xué)上的B型，血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果多表現(xiàn)為AB型，嚴(yán)重影響血型鑒定的準(zhǔn)確性和輸血安全[3-4]。本文對(duì)1例B(A)血型正反定型不符的患者進(jìn)一步行血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了家系調(diào)查分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，秦某，31歲，女，漢族，原發(fā)不孕，無(wú)輸血史，術(shù)前血型檢查中發(fā)現(xiàn)常規(guī)血清學(xué)鑒定正反定型不符。經(jīng)患者及其父母同意后，筆者對(duì)該患者進(jìn)行了分子生物學(xué)分析及家系調(diào)查。

1.2儀器與試劑 主要儀器：LC-10C血庫(kù)配血專用離心機(jī)(安徽中科中佳)，F(xiàn)QD-96A熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(杭州博日科技)，3130基因測(cè)序儀(美國(guó)ABI)。試劑：?jiǎn)慰寺】?A、抗-B血型定型試劑(上海血液生物20171023)，單克隆抗-H、抗-A1定型試劑(江蘇力博20180918)，人ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑(江蘇力博201807006)，抗體篩查細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)(江蘇力博201808009)，DNA提取試劑盒(江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物)，人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒(江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物)，ABO1-7外顯子測(cè)序試劑盒(江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物)。

1.3方法

1.3.1血型鑒定 采用試管法進(jìn)行ABO血型血清學(xué)鑒定，采用抗人球蛋白法進(jìn)行先證者血清的抗體篩查試驗(yàn)和抗人球蛋白試驗(yàn)。以上操作參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)[5]進(jìn)行操作。

1.3.2DNA提取 使用DNA提取試劑盒(江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物)快速抽提乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血中的基因組DNA，DNA標(biāo)本水平為60 ng/mL，純度為1.6～2.0(A260/A280)。

1.3.3ABO基因分型 采用熒光定量PCR法進(jìn)行ABO基因分型(采用人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4ABO基因第6、7外顯子直接測(cè)序 采用ABO1-7外顯子測(cè)序試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1血清學(xué)鑒定結(jié)果分析 先證者及其父母的血型血清學(xué)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)血清學(xué)鑒定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，先證者父親為A型，母親為B型，先證者為可疑B(A)型。先證者的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果不符合遺傳定律，因此需要進(jìn)一步對(duì)該家系進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。

2.2抗體篩查及抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果分析 先證者及其父母的抗體篩查試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，排除存在ABO血型系統(tǒng)以外不規(guī)則抗體的可能性；直接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，表明不存在紅細(xì)胞上黏附的自身抗體對(duì)血型正定型造成干擾的現(xiàn)象；間接抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，可排除血清中存在干擾反定型檢測(cè)的不利因素。

2.3ABO基因分型結(jié)果分析 通過(guò)熒光定量PCR法進(jìn)行ABO基因分型檢測(cè)，A、A205、B、O(261G缺失)、O1、O2特異性引物只擴(kuò)增引物3′末端的第1個(gè)堿基互補(bǔ)的等位基因，而不擴(kuò)增不互補(bǔ)的等位基因，1次擴(kuò)增就可以區(qū)分ABO的等位基因。PCR摻入染料法將熒光染料通過(guò)摻入DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)表示DNA的擴(kuò)增效果。在擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析，通過(guò)熔解曲線分析能確認(rèn)目的產(chǎn)物是否被特異性擴(kuò)增，以此判斷ABO的等位基因。從熔解曲線來(lái)看，先證者B基因和O02基因被特異性擴(kuò)增，先證者父親A基因和O02基因被特異性擴(kuò)增，先證者母親只有B基因被特異性擴(kuò)增，故先證者的基因分型結(jié)果為BO02，其父親的基因型結(jié)果為AO02，其母親的基因型結(jié)果為B/B。

表1 先證者及其父母ABO血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.4ABO基因第6、7外顯子直接測(cè)序結(jié)果分析 對(duì)ABO基因的第6和第7外顯子直接測(cè)序，發(fā)現(xiàn)先證者及其母親存在261G/delG、297A/G、526G/C、640A/G、646T/A、657C/T、681G/A、703G/A、771C/T、796C/A、803G/C、829G/A和930G/A雜合。與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)先證者存在B(A)04等位基因640A>G突變。先證者及其父親存在特征性721C>T雜合，經(jīng)與血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)有相同突變位點(diǎn)的O型等位基因，表明先證者及其父親均含有1條新的O型等位基因。見(jiàn)表2。

表2 先證者及其父母ABO基因第6、7外顯子直接測(cè)序結(jié)果

2.5ABO基因突變位點(diǎn)截圖 見(jiàn)圖1。

注：A、B為先證者特異性突變位點(diǎn)；C為先證者父親特異性突變位點(diǎn)；D為先證者母親特異性突變位點(diǎn)。

2.6家系調(diào)查 先證者家系的血型基因分型結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 先證者家系的血型基因分析

3 討 論

ABO血型基因共有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，位于第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)4帶1、2亞帶(9q34.1～9q34.2)[6-7]，核苷酸序列高度保守，等位基因之間只有幾個(gè)核苷酸的差異，具有高度同源性。其中第6、7外顯子約占編碼區(qū)長(zhǎng)度的77%，編碼91%的糖基轉(zhuǎn)移酶活性區(qū)域[8]，決定著ABO基因一級(jí)產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性與性質(zhì)。糖基轉(zhuǎn)移酶活性的減弱或特異性改變將最終導(dǎo)致A或B抗原的減弱或轉(zhuǎn)變，從而產(chǎn)生ABO亞型[9-10]。

ABO血型正定型的凝集強(qiáng)度通常應(yīng)為3～4個(gè)“+”，反定型則應(yīng)該至少超過(guò)2個(gè)“+”，若結(jié)果異常，則判定為正反定型不符，應(yīng)該從標(biāo)本及試劑質(zhì)量、紅細(xì)胞亞型、疾病(導(dǎo)致抗原或抗體減弱)等因素進(jìn)行全面分析[11]。在本研究中，先證者的標(biāo)本經(jīng)過(guò)2次采集，病史回顧無(wú)特殊。正定型試驗(yàn)中，紅細(xì)胞表面的A抗原較弱，B抗原正常，H抗原增強(qiáng)；反定型試驗(yàn)中，血清與A1細(xì)胞凝集，為4個(gè)“+”，與B細(xì)胞不凝集,結(jié)果判定為正反定型不符。為明確其血型，進(jìn)一步對(duì)先證者進(jìn)行了家系調(diào)查。

先證者父親的基因分型結(jié)果為AO02，測(cè)序結(jié)果有突變位點(diǎn)721C>T雜合，結(jié)合血清學(xué)結(jié)果抗-A 4個(gè)“+”，推斷其一條等位基因?yàn)锳102，另一條等位基因?yàn)镺02的新基因型(721C>T)。先證者母親的基因分型結(jié)果為B/B，測(cè)序結(jié)果有突變位點(diǎn)640A>G雜合，其一條等位基因?yàn)锽(A)04(640A>G)，另一條等位基因?yàn)锽101。先證者的基因分型結(jié)果為BO02，測(cè)序結(jié)果有突變位點(diǎn)640A>G雜合，721C>T雜合。從家系分析推斷：先證者一條等位基因?yàn)锽(A)04(640A>G)，另一條等位基因?yàn)镺02的新基因型(721C>T)。先證者存在的nt640 A>G錯(cuò)義突變使214位甲硫氨酸被纈氨酸置換，從而導(dǎo)致了B等位基因具有編碼A抗原和B抗原雙功能活性酶的能力[11]。對(duì)于另一條O02的新基因型(721C>T)等位基因，從先證者及其父親的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，此突變可能為同義突變，不具有生物學(xué)意義。由此判斷先證者血清學(xué)正反定型不符是由640A>G突變引起的。對(duì)于先證者母親，測(cè)序基因型為B(A)04/B，但其血型血清學(xué)結(jié)果顯示正反定型相符，并沒(méi)有表現(xiàn)出較弱的A抗原?？赡艿脑蛴袃蓚€(gè)：(1)此基因型表現(xiàn)為大量的B抗原和極少量的A抗原，在血清學(xué)試驗(yàn)中極少量的A抗原被大量的B抗原掩蓋，故正定型為B型。(2)國(guó)產(chǎn)的單克隆抗體試劑存在對(duì)B(A)血型的漏檢現(xiàn)象。存在這種現(xiàn)象的原因是單克隆ABO血型定型試劑采用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)，針對(duì)的是1種血型抗原的單個(gè)抗原決定簇，無(wú)法識(shí)別所有的ABO血型抗原，尤其是ABO血型系統(tǒng)的弱A、弱B抗原。B(A)亞型抗原表位上功能基因的不同、位置的差異，甚至立體構(gòu)象的變化等，都無(wú)法被單克隆抗體識(shí)別，從而出現(xiàn)漏檢的情況[1]。

在日常實(shí)驗(yàn)室工作中，若遇到血清學(xué)方法無(wú)法確定的疑難血型標(biāo)本，應(yīng)采用基因分型技術(shù)進(jìn)一步鑒定，必要時(shí)需進(jìn)行家系調(diào)查，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，保障臨床用血安全。