PCOS患者外泌體中差異表達的蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)及其作用機制研究進展

張建馨，王曉彤，李洋，臧怡平，于竟，杜伯濤

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院生殖中心，哈爾濱 150086)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最常見的內(nèi)分泌疾病，患病率約為10%～20%[1]，以多囊卵巢、高雄激素血癥、胰島素抵抗(IR)和稀發(fā)性排卵為主要臨床表現(xiàn)，易并發(fā)肥胖、2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病(CVD)和子宮內(nèi)膜癌等疾病。PCOS的發(fā)病機制尚不完全清楚，環(huán)境和遺傳因素被認為是PCOS發(fā)生的潛在原因。

近年來多項研究表明，外泌體存在于PCOS患者卵泡液和血液中，并可通過傳遞多種蛋白質(zhì)、miRNAs、lncRNAs和circRNAs等調(diào)節(jié)細胞生理功能。本文就PCOS患者外泌體中差異表達的蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)等及其相關(guān)作用機制做一綜述。

一、外泌體概述

外泌體是由細胞分泌的直徑為40 nm～150 nm的細胞外囊泡[2]。外泌體在生理和病理條件下均可由幾乎所有類型的細胞產(chǎn)生，并通過體液(例如血液、唾液、母乳等)廣泛分布[3]。外泌體通過細胞內(nèi)多囊泡的內(nèi)陷形成，然后融合到質(zhì)膜上，最后釋放到細胞外。它通常在生理條件下由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的囊泡結(jié)構(gòu)通過質(zhì)膜釋放以對附近的細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[4]。外泌體是細胞信號傳遞的重要媒介，可以保護信號通路不被中斷[5]。外泌體中含有細胞特異的各種蛋白質(zhì)、miRNAs、lncRNAs和circRNAs等，并通過體液到達遠端的組織和器官，釋放攜帶的因子，調(diào)節(jié)細胞生理功能，它們可以反映來源細胞的病理和生理狀態(tài)。

二、PCOS外泌體中相關(guān)蛋白質(zhì)

目前，關(guān)于人卵泡液中外泌體的蛋白質(zhì)組學分析已有一些研究，但是與PCOS發(fā)生機制相關(guān)性的報道很少。Li等[7]通過比較PCOS和健康女性卵泡液中外泌體的蛋白質(zhì)組學特征，發(fā)現(xiàn)兩組均含有S100-A9蛋白，而PCOS患者中的S100-A9蛋白表達量更高；除此之外，富含S100-A9的外泌體可以顯著上調(diào)卵泡液中幾種促炎因子和趨化因子的表達，如IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等，而上述炎癥介質(zhì)的過表達正反饋增強S100-A9的表達。

S100-A9屬于25個同源的低分子量細胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白家族，主要由活化的粒細胞釋放，通過與細胞表面受體結(jié)合觸發(fā)參與炎癥反應(yīng)的信號通路，并在細胞增殖、分化和遷移等過程中發(fā)揮重要作用[8]。富含S100-A9的外泌體能夠激活顆粒細胞中NF-κB信號通路，促進炎癥反應(yīng)并破壞類固醇生成。研究表明，PCOS是一種炎癥狀態(tài)，可以使卵泡液和血漿中炎癥標志物水平增加，巨噬細胞/單核細胞募集增強，卵巢局部炎癥加重。而NF-κB是炎癥調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，且在PCOS合并IR的患者中血清NF-κB明顯高于正常對照組患者[9]。CYP17是雄激素代謝途徑中的關(guān)鍵酶，CYP17的活性增強可以促進PCOS患者中雄激素的生物合成和分泌。外泌體富集的S100-A9通過NF-κB通路顯著上調(diào)CYP17 mRNA的表達，從而干擾了類固醇生成。表明外泌體中的S100-A9主要通過NF-κB途徑干擾了幾種基因的表達和激素信號傳導，這可能與PCOS的發(fā)生機制有關(guān)。

三、PCOS外泌體中相關(guān)遺傳物質(zhì)

1.miRNAs：微小RNA(miRNAs)是由20～25個核苷酸組成的一種短鏈非編碼RNA(ncRNA)分子，可通過抑制翻譯或結(jié)合靶標mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)誘導轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解而發(fā)揮基因表達調(diào)控作用[10]。越來越多的研究表明，miRNAs可以調(diào)控細胞生長發(fā)育、凋亡、代謝、應(yīng)激反應(yīng)和造血分化等多種關(guān)鍵的生物學功能。此外，循環(huán)中異常表達的miRNAs 還與PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥、糖尿病等相關(guān)。然而我們對miRNAs與PCOS之間的確切關(guān)系的認識仍是初步的，miRNAs在PCOS的診斷和治療中的潛在作用還有待明確。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者外泌體中存在差異表達的miRNAs，而由外泌體相關(guān)miRNAs介導的細胞間信號傳遞新機制引起了廣泛關(guān)注。

1.1 miR-320：劉凱魯?shù)萚11]和Sang等[12]均發(fā)現(xiàn)PCOS患者外泌體中miR-320的表達水平低于對照組。miR-320可靶向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子E2F1和SF-1的表達，從而抑制顆粒細胞的增殖和雌激素的生成，并促進孕酮的生成[13]。也有研究表明，miR-320a/RUNX2/CYP11A1(CYP19A1)級聯(lián)反應(yīng)與PCOS患者中雌激素缺乏癥有密切聯(lián)系，miR-320a的缺乏使RUNX2失調(diào)，進而會影響PCOS患者的卵丘顆粒細胞中的類固醇生成[14]。因此，檢驗患者的miR-320a/RUNX2表達比可能會提供更準確的診斷信息，并可能影響PCOS的推薦治療方案。除此之外，miR-320還與IR有關(guān)。有研究認為，miR-320負調(diào)控其靶點基因ET-1表達[15]，通過IRS-1參與調(diào)控卵泡成熟的ERK1/2信號通路，進而抑制PCOS患者的IR[16]。

1.2 miR-27a-5p：PCOS患者罹患子宮內(nèi)膜癌(EC)的風險明顯增加，而位于19號染色體上的miR-27a在PCOS患者子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。Che等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，PCOS患者的血清外泌體中miR-27a-5p含量更高，并證實miR-27a-5p模擬物轉(zhuǎn)染EC細胞系Ishikawa和HEC-1A后，可以通過直接作用于靶向基因SMAD4促進EC細胞的遷移和侵襲。除此之外，也有研究表明，miR-27a-3p在PCOS小鼠模型卵巢中高表達，并通過下調(diào)Creb1及其下游Cyp19a1的表達，抑制雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化，導致雄激素積累；而雄激素可誘導miR-27a-3p的表達，并通過miR-27a-3p/Creb1/Cyp19a1通路影響顆粒細胞功能，進一步加劇雌激素和雄激素的失衡[18]。

1.3 miR-483-5p：有研究發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p在PCOS卵泡液外泌體中表達明顯下降[19]。而王潔等[20]發(fā)現(xiàn)，在PCOS血清外泌體中miR-483-5p的表達明顯上升。胰島素生長因子(IGF1)是miR-483的3p直接靶基因，miR-483-5p通過調(diào)控IGF1和PIK3R1激活PI3K/AKT從而降低IR[21]。除此之外，miR-483-5p被發(fā)現(xiàn)在PCOS患者的卵丘顆粒細胞中高表達并抑制MAPK3的蛋白表達，從而阻斷MAPK信號通路、調(diào)控卵丘顆粒細胞的增殖分化[22]。MAPK信號通路是胰島素信號通路之一，它可以介導有絲分裂，并在調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，外泌體中miRNA可能通過影響胰島素靶細胞的增殖和分化來促進PCOS患者胰島素抵抗的發(fā)生。此外，P38/MAPK蛋白還被發(fā)現(xiàn)在卵母細胞表達，外泌體可能通過調(diào)節(jié)卵母細胞成熟參與PCOS發(fā)生發(fā)展[23]。

1.4 miR-146-5p：Jiang等[24]發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p在PCOS患者血清外泌體中表達明顯上升。有研究表明，miR-146a變異的女性罹患PCOS的風險更高，這可能與miR-146a的上調(diào)有關(guān)[25]。miR-146與炎癥反應(yīng)和IR有關(guān)，miR-146作為先天免疫反應(yīng)中的負反饋調(diào)節(jié)通路的因子，避免機體發(fā)生過度的炎癥反應(yīng)；miR-146可以直接抑制TLR下游幾個促炎分子的表達，包括IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)、IL-1受體相關(guān)激酶2(IRAK2)和TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)等[26]。有實驗發(fā)現(xiàn)PCOS小鼠模型中miR-146a表達上調(diào)，且慢性低度炎癥和氧化應(yīng)激可能是PCOS的主要病因[27]。有實驗驗證miR-146a的直接靶基因中約有54%與胰島素敏感性相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)miR-146a與miR-155正相關(guān)[28]。這兩種miRNA被認為可能是FoxO1基因調(diào)節(jié)劑，而FoxO1基因是胰島素信號級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵下游介質(zhì)[29]。因此，外泌體中的miR-146a是否通過miR-146a/FoxO1參與PCOS及IR的發(fā)生發(fā)展還需進一步探究。除此之外，F(xiàn)oxO1在促進PCOS的卵泡閉鎖和GCs凋亡中起著重要作用[30]。

1.5 miR-199：研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液外泌體中的miR-199 在PCOS組的表達水平低于對照組[11]。然而，與之相反，也有研究顯示PCOS患者卵泡液外泌體中的miR-199表達顯著上調(diào)[19]。Shao等[31]通過雙熒光素酶基因測定，鑒定WT1為miR-199a-5p的靶基因，并且抑制miR-199a-5p可導致WT1介導的JAK/STAT3途徑的激活，表明miR-199a-5p可能通過WT1介導的JAK/STAT3通路調(diào)控PCOS的發(fā)生機制。同時，miR-199a-5p可以刺激PCOS卵巢顆粒細胞凋亡。

2.lncRNA：長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種非編碼RNA，它的長度超過200個核苷酸。Karreth等[32]提出了一種稱為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)的理論，即lncRNA、mRNA和假基因可以競爭性地與microRNA反應(yīng)元件(MRE)結(jié)合并相互作用進而調(diào)控基因表達，這提供了一種新的基因調(diào)控機制。劉琳等[33]通過高通量測序發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液外泌體內(nèi)存在差異表達的 lncRNA，并通過實時定量PCR(RT-qPCR)驗證發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液外泌體中DNMT1、DNMT2、DNMT3A和H19的表達水平顯著下降，而SGK1表達水平顯著增加。

顆粒細胞(GCs)增殖可能是PCOS發(fā)生機制之一，而它的調(diào)控途徑尚不完全清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)，lnc-MAP3K13-7：1在PCOS患者的GCs中高表達，伴有DNA低甲基化、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)表達降低和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A，p21)表達增加[34]。而依賴DNMT1的CDKN1A啟動子低甲基化促進CDKN1A轉(zhuǎn)錄，抑制GCs增殖。也有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度睪酮可以下調(diào)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達，降低PDCD4啟動子區(qū)的甲基化水平，這可能與雄激素誘導GCs凋亡的機制有關(guān)[35]。

Qin等[36]發(fā)現(xiàn)lncRNA H19表達水平與PCOS發(fā)病風險顯著相關(guān)，且與空腹血糖水平呈正相關(guān)。所以對于易感人群，lncRNA H19可能成為PCOS早期診斷的生物標志物。Sun等[37]通過實驗證實了lncRNA H19作為ceRNA在KGN細胞中的作用，其通過lncRNA H19/miR-19b/CTGF調(diào)節(jié)軸調(diào)節(jié)CTGF的表達，而異常表達的CTGF可以參與PCOS顆粒細胞增殖和卵巢纖維化過程，最終影響PCOS的發(fā)病機制。

3.circRNA：環(huán)狀RNA(circRNA)是一種穩(wěn)定的內(nèi)源性非編碼RNA，可以調(diào)節(jié)基因表達并發(fā)揮多種生物學作用。circRNA的特征是共價閉環(huán)而無5′或3′極性，特殊的共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)使其比傳統(tǒng)線性RNA更穩(wěn)定，可長時間抵抗RNase和核酸外切酶的生物學功能。

為了研究circRNA的潛在作用，Wang等[38]以非PCOS樣本為對照，對PCOS患者卵泡液外泌體進行了測序，生物信息分析發(fā)現(xiàn)，有167個 circRNA表達顯著上調(diào)和245個 circRNA表達顯著下調(diào)。PCOS患者中，不同的 circRNA可能與細菌感染、慢性炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的通路有關(guān)。除此之外，Huang等[39]通過RNA測序比較了PCOS和對照組患者卵泡液外泌體的circRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)16個circRNA顯示出表達差異，其中hsa_circ_0006877(circLDLR)由低密度脂蛋白受體(LDLR)基因轉(zhuǎn)錄加工而成，該基因參與了卵巢類固醇生成；通過cytoscape軟件預(yù)測了circLDLR-miR-1294-CYP19A1競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)網(wǎng)絡(luò)，并通過熒光素酶檢測及在PCOS患者卵丘細胞中相關(guān)表達得到證實。最終證實外泌體中的circLDLR會增加受體細胞中miR-1294的表達并抑制CYP19A1的表達，并降低其雌激素的分泌，外泌體這可能與PCOS的發(fā)生機制有關(guān)。

四、總結(jié)與展望

近年來，對PCOS的研究主要基于基因改變和表觀遺傳學等傳統(tǒng)領(lǐng)域，而PCOS患者外泌體中差異表達的蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)等及其相關(guān)作用機制也已引起廣泛關(guān)注。隨著從不同類型的外泌體中分離出各種蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)，人們逐漸認識到它們在細胞信號傳遞和表觀遺傳調(diào)控中的關(guān)鍵作用。重要的是，無論是在病理狀態(tài)還是生理狀態(tài)下，外泌體的含量都受到其親代細胞的精細調(diào)節(jié)，通過將信息從親代細胞傳遞給其他細胞以實現(xiàn)特定功能。反過來，也可以通過分析其外泌體含量來估計親代細胞的功能狀態(tài)，這為基于外泌體的診斷奠定了基礎(chǔ)。因此，外泌體有望成為一種新型的標志物來評估多囊卵巢的狀況，深入研究外泌體的作用和作用機制，尤其是外泌體中各種蛋白質(zhì)、miRNA、lncRNA和circRNA等，將為治療多囊卵巢提供新的策略，最終可能為其診斷、治療和預(yù)后提供重大創(chuàng)新。雖然外泌體顯示出潛在的重要性和意義，但外泌體應(yīng)用于臨床的可能性還需要更多更有力的證據(jù)支持。