蛋白多肽類藥物長效化技術(shù)研究策略

龐麗然, 賀丞, 魏敬雙, 高健

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司, 抗體藥物研制國家重點實驗室, 石家莊 050015

治療性多肽和蛋白質(zhì)具有結(jié)合力高、特異性強(qiáng)、溶解度高、毒性低的特點，大量的蛋白質(zhì)和多肽療法進(jìn)入了醫(yī)藥市場[1]。但是除抗體類藥物外，大多數(shù)蛋白類藥物半衰期較短，必須通過頻繁給藥或提高劑量才能達(dá)到預(yù)期的治療效果，這樣不僅給病人帶來巨大的痛苦和潛在的風(fēng)險，也給病人帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，為了延長治療肽和蛋白質(zhì)的半衰期，提高其藥代動力學(xué)/藥效學(xué)性質(zhì)，人們在化學(xué)改造、基因工程和藥物動力學(xué)等方面進(jìn)行了大量的研究，已開發(fā)了多種有效的長效策略。

1 決定半衰期的重要因素

多肽和蛋白質(zhì)通常比小分子更不容易穿過上皮細(xì)胞，更易被宿主代謝，所以大多數(shù)生物藥物都是通過皮下或靜脈注射給藥的。蛋白質(zhì)療法在臨床應(yīng)用中面臨的最大挑戰(zhàn)之一是其在血清中的快速降解，以及由于酶降解、腎清除、肝代謝和免疫原性而導(dǎo)致的快速消除[2]。除了單克隆抗體具有長達(dá)一周的血清半衰期外，大多數(shù)蛋白類藥物很快就會從體內(nèi)消失，半衰期短。

蛋白質(zhì)的去除率依賴于多種因素，比如尺寸、分子量、表面電荷等[3]。蛋白質(zhì)分子的大小和疏水性使其易于腎臟濾過和肝臟代謝。腎濾過閾值約為50～60 kD，生物制藥分子量在60 kD以下的通過腎臟過濾。另一方面，生物體內(nèi)廣泛存在各種蛋白水解酶，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)破壞的蛋白酶體具有特異性識別幾乎所有外來蛋白質(zhì)的能力，同時能夠避免對細(xì)胞成分的任何不必要的破壞；生物藥物在細(xì)胞膜上的滲透性很差，而細(xì)胞攝取途徑通常導(dǎo)致溶酶體中的藥物降解。因此，半衰期延長策略的成功與否取決于該技術(shù)能否操縱一個或多個這些因素。

2 聚合物類對治療性蛋白/多肽的修飾

2.1 聚乙二醇(pegylation, PEG)修飾

聚乙二醇化(PEG)是20世紀(jì)70年代一種很受歡迎的蛋白質(zhì)修飾技術(shù)。聚乙二醇本身是一種不帶電的親水聚合物，不可生物降解，大部分無毒性[4]。PEG鏈?zhǔn)怯森h(huán)氧乙烷(CH2-CH2-O)的重復(fù)單位構(gòu)成的分子。肽鏈共價連接在一個或多個高分子量PEG鏈上，賴氨酸和多肽鏈的 N-末端的氨基酸殘基是最常用的 PEG 化位點。延長半衰期的作用是通過隱藏肽的抗原決定因素，使抗體不能認(rèn)識到它是一個異物，并增加蛋白質(zhì)的大小，使它不會被腎臟輕易清除。高度靈活的聚乙二醇分子很容易附著在治療分子上。聚乙二醇化也有助于吸收,增強(qiáng)蛋白質(zhì)的水溶性，并掩蓋分子避免蛋白水解或降解[5]。PEG一般認(rèn)為是安全的，然而并不是百分之百安全，因為它是不可被生物降解的，具有免疫原性。從目前已上市的幾種PEG化藥物的情況來看，長效化效果明顯[6]。

非格司亭(filgrastim)是一種重組蛋氨酸人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，在化療期間能夠刺激中性粒細(xì)胞的供應(yīng)預(yù)防胎兒中性粒細(xì)胞減少癥(FN)，需每日注射。聚乙二醇化的非格司亭為乙二醇化非格司亭，它只需要每個周期注射一次[7]；Enzon開發(fā)的Oncaspar，是PEG化的L-天東酰胺酶，半衰期比原L-天東酰胺酶延長了16倍[8]。Amgen的短效化GCSF在一個化療周期需要多次注射，而其長效化的PEG-GCSF(neulasta)一個化療周期中只需給藥1次即可維持藥效[9]。國內(nèi)上市的PEG化生物藥物有石藥集團(tuán)的聚乙二醇化重組人粒刺激因子(PEG-rhG-CSF)、長春金賽的聚乙二醇化重組生長激素PEG-rhGH等。

2.2 改性的PEG修飾

在過去的幾十年里，研究人員一直在努力研發(fā)PEG偶聯(lián)療法，將聚乙二醇修飾和共軛到其他分子上。

2.2.1糖基化-PEG修飾傳統(tǒng)上，PEG通過共價鍵連接到氨基酸反應(yīng)基團(tuán)上與蛋白質(zhì)結(jié)合。新的糖基化-PEG修飾方法將PEG連接到O-聚糖上。因此，它由糖基轉(zhuǎn)移酶位點定向聚乙二醇化。該方法可以使形成的異構(gòu)體最小化，同時能夠提高PEG延長半衰期的性能[10]。

2.2.2生物素化的PEG修飾近年來，通過將聚乙二醇與鏈霉親和素偶聯(lián)得到了一種改性聚乙二醇[11]。研究表明，采用生物素化-聚乙二醇技術(shù)，可以改善循環(huán)停留時間。它具有巨大的潛力，可用于蛋白質(zhì)和肽治療的藥物動力學(xué)增強(qiáng)劑。

3 重組多肽類對治療性蛋白/多肽的修飾

近年來，蛋白質(zhì)半衰期延長的新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，包括非結(jié)構(gòu)多肽鏈。就像聚乙二醇，多肽聚合物附著到蛋白質(zhì)上，增加它們的水動力半徑，使它們不易于腎濾過。但與聚乙二醇不同，多肽聚合物可生物降解,無毒、無免疫原性、親水，屬中性聚合物。另外，多肽聚合物的合成技術(shù)簡單，效益也很高[12]。

3.1 非結(jié)構(gòu)多肽XTEN

XTEN是Amunix公司開發(fā)的蛋白質(zhì)聚合物，用途廣泛，可替代非生物降解的聚合物，用于延長半衰期。XTEN是一種非結(jié)構(gòu)多親水性、可生物降解的蛋白質(zhì)聚合物，由數(shù)量有限的單體組成。XTEN具有多肽的性質(zhì)，使其有望用于延長半衰期[13]。與化學(xué)聚合物不同，XTENs沒有特定的結(jié)構(gòu)。和聚乙二醇一樣，XTEN也能延長蛋白質(zhì)的半衰期，增加分子的大小和水動力半徑，這說明，XTEN是很好的PEG替代品。XTEN由大腸桿菌表達(dá)，包含A、E、G、P、S和T的氨基酸序列庫。已有研究將XTEN多肽與Exenatide、胰高血糖素(Gcg)、胰高血糖素樣肽2(GLP2)類似物[14-15]，膜聯(lián)蛋白等進(jìn)行融合，測試評估其效果，表明XTEN能夠增強(qiáng)藥物的半衰期和降低免疫原性[16]。

3.2 脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸(PAS)

PAS是慕尼黑工業(yè)大學(xué)開發(fā)的另一種多肽聚合物，工作原理與PEG類似，具有生物可降解的多肽分子的所有特性[17]。PAS是一種100～200重復(fù)序列的非結(jié)構(gòu)肽聚合物，是由脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸這3種氨基酸隨機(jī)排列而成的重復(fù)序列。PAS聚合物對血清蛋白酶有抗性，但仍然存在可被腎臟蛋白酶降解的風(fēng)險。PAS多肽是無毒的，缺乏T細(xì)胞表位，在動物實驗無免疫原性征象[18]。PAS多肽已被廣泛應(yīng)用于治療多肽和蛋白質(zhì)，包括激素、細(xì)胞因子、抗體片段與酶[19]。研究表明生物制藥的半衰期也可以通過改變PAS聚合物的長度很容易地調(diào)整，來實現(xiàn)特定的應(yīng)用[19-20]。最初有3種蛋白作為模型藥物進(jìn)行了測試：重組Fab片段、干擾素α2b(IFN α2b)[21]和人類生長因子(生長激素hGH)。不同的PAS序列與Fab片段結(jié)合，使半衰期增加2～25倍。rFab本身單獨半衰期只有1.34 h，PAS修飾后半衰期為2.71～37.00 h。研究顯示PAS修飾的 IFN半衰期增加了5～30倍，hGH半衰期增加94倍。除此還有多種生物活性蛋白與200～600個殘基的PAS融合，比如IFNβ激動劑、小鼠瘦素[22]和人鐵蛋白[23]。

3.3 類彈性蛋白多肽ELP

另一種多肽融合技術(shù)是類彈性蛋白多肽(elpylation)。就像XTEN和PAS，ELP也是含有V-P-G-x-G重復(fù)序列的隨機(jī)序列，主要存在于彈性蛋白中，x指的是除脯氨酸以外的任何氨基酸[24]。由于它與彈性蛋白具有較高的相似性，這使得它更容易被人類的彈性酶識別降解，賦予了它可生物降解的特性。ELP像PEG及其他多肽聚合物一樣，通過增加水動力半徑以延長半衰期，已被用于延長肽和蛋白質(zhì)的半衰期[25-26]，包括IL-1受體拮抗劑、IL-4、IL-10、GLP-1和HIV中和抗體等。有趣的是，GLP-1-ELP融合蛋白在室溫和體溫之間表現(xiàn)出溶解-不溶解相變?？尚纬梢粋€具有緩釋特性的注射存庫，可在單次注射后，使小鼠的血糖水平降低維持5 d[27]。據(jù)報道描述，IL-1受體拮抗劑-ELP 融合蛋白也會有類似的結(jié)果，注射后形成一個藥物存庫[28]。

3.4 富含甘氨酸的聚多肽(HAP)

HAP修飾是一種富含甘氨酸(Gly4Ser)n多肽的重復(fù)序列的活性分子，由100～200的重復(fù)殘基組成。HAP修飾在動物模型中顯示對Fab的半衰期呈上升趨勢。200個HAP殘基偶聯(lián)到Fab殘基顯示在體內(nèi)有較長時間的半衰期(6 h)。但研究遇到了一個重大難題是(Gly4Ser)n的溶解度與半衰期之間的矛盾:HAP溶解度依賴于鏈長，鏈長增加會大大降低溶解度。然而較短的鏈不能很有效地提高半衰期，因此這種技術(shù)沒有得到進(jìn)一步發(fā)展。

3.5 明膠樣蛋白(GLK)

明膠樣蛋白(GLK)是一類具有生物活性的重組多肽，可用于延長半衰期，它是由(Gly-XY)n的重復(fù)序列組成，其中X和Y指除Cys除外任何天然的氨基酸，n是在60～1 500個氨基酸殘基之間(最好是200～1 000)，分子量為6～150 kD(最好是20～80 kD)。通過基因融合制備的不同GLK修飾的G-CSF，使其在大鼠中的半衰期從1.76 h延長到10 h。

4 天然蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)χ委熜缘鞍?多肽的修飾

有一些天然的蛋白質(zhì)分子具有超長的半衰期，因此血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等蛋白首先被認(rèn)為是延長其他治療性蛋白半衰期的基團(tuán)。轉(zhuǎn)鐵蛋白的半衰期較長是由于與網(wǎng)格蛋白依賴的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，而白蛋白的長半衰期是新生兒Fc受體(FcRn)介導(dǎo)循環(huán)的結(jié)果。pH依賴的FcRn受體介導(dǎo)的循環(huán)作用機(jī)制也適用于人免疫球蛋白IgG抗體[29-30]。

4.1 與白蛋白結(jié)合

白蛋白具有一些獨特的特性，如血漿半衰期約19 d，負(fù)電荷表面具有多價結(jié)合位點等，這使該分子成為理想的肽類藥物的運載工具和半衰期延長劑的候選物。Albiglutide(Tanzeum)是第一個直接與HSA融合的治療蛋白，它在2014年被FDA批準(zhǔn)用于治療T2DM[31]。Albutrepenonacog alfa(Idelvion)是一種重組蛋白人凝血因子IX(FIX)融合蛋白，于2016年獲得FDA批準(zhǔn)用于血友病B患者的出血治療與預(yù)防。Albutrepenonacog alfa蛋白的半衰期為90～104 h, 比原蛋白FIX的半衰期(18～34 h時)長5倍。

4.1.1與白蛋白的非共價結(jié)合在輔助分子的幫助下，比如通過非共價鍵連接脂肪鏈，實現(xiàn)白蛋白與治療性肽間接結(jié)合。白蛋白是研究充分的轉(zhuǎn)運蛋白，能夠有效并可逆地結(jié)合一系列內(nèi)源性配體包括脂肪酸、膽紅素和少數(shù)外源性配體，如青霉素、華法林、安定等。使用脂肪酸作為配體也被稱為“脂化”。白蛋白與這些分子結(jié)合提高了它們的生物利用度。利用該技術(shù)開發(fā)的兩個著名的多肽藥物是地特胰島素(levemir?)和利拉魯肽(victoza?)[32-33]。

4.1.2與白蛋白的共價偶聯(lián)治療性蛋白藥物與白蛋白分子的共價結(jié)合是另一種延長蛋白半衰期的途徑。它可以通過蛋白質(zhì)和白蛋白的化學(xué)結(jié)合來實現(xiàn)。直接將蛋白藥物與轉(zhuǎn)基因白蛋白或白蛋白衍生物而不是內(nèi)源性白蛋白結(jié)合，進(jìn)一步為延長半衰期提供了靈活條件?；瘜W(xué)偶聯(lián)的優(yōu)點是治療分子與白蛋白的連接位點不再局限于N 端或C 端。PC-DACTM是一種體外HSA 預(yù)耦合技術(shù)，將蛋白質(zhì)/多肽連接子復(fù)合物在體外與HSA 蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，直接形成治療分子白蛋白復(fù)合物。研究者通過該技術(shù)對艾塞那肽進(jìn)行修飾，然后再與重組人血白蛋白結(jié)合。艾塞那肽是一種天然存在的肽激素，對治療糖尿病具有很好的作用。但半衰期只有33 min，糖尿病患者需一天注射一次。通過PC-DACTM可以延長艾塞那肽的血漿半衰期，從而使藥物作用時間延長。該藥物在體內(nèi)的半衰期可達(dá)到7 d，因此臨床上可以做到患者每周只需注射一次，極好地增加了患者的使用便捷性并能更穩(wěn)定的控制血糖。白蛋白衍生物是一類對延長血清半衰期具有廣泛應(yīng)用前景的重組蛋白。

4.1.3與白蛋白的基因融合與共價結(jié)合一樣，基因融合技術(shù)也能制備與白蛋白結(jié)合的融合蛋白。這提供了一個更簡單的程序，由于制造過程發(fā)生在生物體或細(xì)胞系內(nèi)，并完全折疊成功，可直接收集蛋白[34]。治療肽可在白蛋白的一端(N或C端)或兩端(雙特異性白蛋白融合)與白蛋白結(jié)合。HSA融合的蛋白藥物是非糖基化還是糖基化蛋白決定了采用酵母或CHO細(xì)胞表達(dá)，成本低且純化方便，使得其具有作為藥物長效化載體的經(jīng)濟(jì)效益性。HSA融合蛋白的主要優(yōu)點是其免疫原性低、作為惰性蛋白能增加蛋白穩(wěn)定性[35]。

4.2 Fc融合

IgG偶聯(lián)蛋白延長半衰期主要是基于Fc域融合。結(jié)構(gòu)上，IgG的恒定區(qū)域 Fc區(qū)為二價，為藥物結(jié)合提供了靈活性[36]。從概念上講，二價結(jié)合是親和效應(yīng)的一個額外優(yōu)點。蛋白質(zhì)分子可以添加到Fc中區(qū)域融合位點(N端或C端)或插入環(huán)路形成[37]。首個Fc融合蛋白依那西普(Enbrel)1998年獲得FDA批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。多肽的藥代動力學(xué)特征可以通過基因融合到Fc結(jié)構(gòu)域的兩個分支上而得到改善，從而產(chǎn)生雙價結(jié)構(gòu)融合蛋白。Dulaglutide(Trulicity)，GLP-1受體激動劑每周注射一次，在2014年被批準(zhǔn)用于治療2型糖尿病(T2DM)。Dulaglutide由兩個具有多個突變的相同GLP-1分子組成(A8G/G22E/R36G)，通過一個小肽鏈融合到IgG4-Fc區(qū)(F234A/L235A)。Dulaglutide的半衰期延長至5 d左右,與?？宋骷{替德(exenatide)、利拉格魯肽(liraglutide)和利克西納替德(lixisenatide)相比半衰期要長得多，這些藥物必須每日服用1～2次[38]。

Fc作為半衰期延長手段的另一個應(yīng)用是單分子Fc的利用。Efraloctocog-α(eloctate)包括一個凝血因子ⅧB域與Fc二聚體融合，并被批準(zhǔn)用于治療血友病A，efraloctocog-α半衰期為19 h，而重組因子Ⅷ延長了1.5倍。兩種用于治療Eftrenonacog-α(Alprolix)的單價Fc融合蛋白被FDA批準(zhǔn)用于治療血友病B[39]，由單一FIX，融合到IgG1的Fc二聚體。Eftrenonacog-α的半衰期為53～82 h，比重組FIX(19 h)長3～5倍[40-41]。除了延長半衰期外，F(xiàn)c融合有時還能改善蛋白質(zhì)的生理機(jī)能，如增加溶解性和穩(wěn)定性。在Fc介導(dǎo)的半衰期延長的制劑藥物中，ADCC具有抗體依賴性細(xì)胞毒性，CDC具有互補(bǔ)依賴性細(xì)胞毒性，這些問題通過CH3-CH3雜化得到了解決。

4.3 轉(zhuǎn)鐵蛋白融合

血清轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠與鐵分子可逆結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運到組織。轉(zhuǎn)鐵蛋白在血清中的半衰期是7～10 d(非糖基化Tf為14～17 d)，它作為融合分子是延長蛋白質(zhì)半衰期的良好候選物[42]。有一項研究有關(guān)丙胰島素與轉(zhuǎn)鐵蛋白融合(ProINS-Tf)。ProINS-Tf融合蛋白在老鼠體內(nèi)，顯示具有較長時間的半衰期，能夠緩慢持續(xù)地降糖。ProINS-Tf血清中的半衰期為7.29 h，而ProINS半衰期只有0.5 h[43]。

5 碳水化合物對治療性蛋白/多肽的修飾

在生物系統(tǒng)中，糖基化起著維護(hù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及防止酶降解的作用。糖基化是蛋白質(zhì)與碳水化合物的共價修飾。蛋白質(zhì)的固有性質(zhì)是由連接在它鏈上的糖分子改變，最終改變其四級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和對蛋白酶的抗性。這種自然保護(hù)系統(tǒng)可用于設(shè)計新的延長半衰期的生物療法。此外，寡糖基化合物還具有增大尺寸、通過在蛋白質(zhì)中添加負(fù)電荷來降低腎清除、調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、防止蛋白水解降解等作用，使糖基化成為延長治療半衰期的常用方法[44]。糖基化位點的引入增加了肽或蛋白質(zhì)的負(fù)電荷，導(dǎo)致腎清除速度減慢[45]。商用EPO類似物，Darbapoietin α含有兩個額外的N糖，其半衰期為26.3 h，是原生半衰期的3倍。

5.1 聚唾液酸化(polysialylation)

天然產(chǎn)生的唾液酸聚合物(PSA)是碳水化合物鏈，可生物降解，在自然界高度親水，在體內(nèi)并沒有確定的受體。因此，翻譯后修飾的治療肽和蛋白質(zhì)末端唾液酸能改善藥物的藥代動力學(xué)，降低免疫原性，從而改善他們的整體效率[46]。Jain等[47]研究發(fā)現(xiàn)，多唾液酸化胰島素對于糖尿病的治療具有明顯的治療價值。他們發(fā)現(xiàn)與正常胰島素相比，胰島素與22 kD PSA聚合物結(jié)合，體內(nèi)治療顯示它能較長時間地降低血糖水平，延長藥物作用時間。類似的結(jié)果也發(fā)生在其他幾項蛋白療法研究中，如抑肽酶和IgG免疫球蛋白。聚唾液酸化的丁酰膽堿酯酶(bChE)，使它在小鼠體內(nèi)半衰期從3 h延長到14 h。多種多唾液酸生物治療藥物正在臨床開發(fā)中，如PSA-EPO(ErepoXen)、PSA-DNaseⅠ(PullmoXen)、PSA-RFⅧ等。

5.2 HEPylation

肝素前體(HEP)是一種天然多糖，水溶性好。HEP作為肝素的前體，它被機(jī)體認(rèn)為是體內(nèi)物質(zhì)，因此不會產(chǎn)生任何免疫原性問題[48]。Wei等[49]用肝素前體代替PEG與重組人粒集落刺激因子(G-CSF)結(jié)合，在小鼠體內(nèi)長時間重復(fù)劑量給藥，并不會引起毒性反應(yīng)及免疫原性反應(yīng)，肝素前體是一種安全的PEG替代品。因此，它被認(rèn)為可用于延長半衰期，并且可做為生物降解的一個很好的選擇。肝素前體及其衍生物因具有作為多種藥物制劑的潛力備受關(guān)注。肝素前體在血液中的半衰期為15 h～8 d，這取決于分子量和給藥途徑。

6 展望

長效蛋白藥物具有極大臨床優(yōu)勢，延長半衰期已成為許多生物療法發(fā)展的一個重要策略，諸多長效蛋白藥物已成功開發(fā)上市。長效創(chuàng)新藥使給藥頻次大大降低、依從度更高、治療效果更優(yōu)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，也給長效化帶來了新的思路，開發(fā)其他劑型及給藥途徑也日益受到關(guān)注。研究人員開發(fā)了各類藥物傳遞系統(tǒng)(DDS)，包括緩釋注射劑、植入劑、微球注射劑[50]、脂質(zhì)體注射劑[51]及納米粒注射劑[52]等。目的是通過載體控制藥物的釋放、提高藥物的穩(wěn)定性，同時提高難溶藥物的溶解性及靶向性。研究者也嘗試通過口服或經(jīng)皮給藥替代注射給藥途徑。在長效策略研發(fā)過程中也有一些挑戰(zhàn)需要解決，臨床安全和免疫原性問題一直存在。對任何延長半衰期的策略進(jìn)行充分的PK和PD研究，消除副作用，同時也要綜合考慮藥物特性、生物因素、臨床需求、生產(chǎn)成本等各方面因素。從長遠(yuǎn)來看，蛋白及多肽類藥物的長效化具有重要的臨床意義和廣闊的市場前景。雖然許多新穎的延長半衰期的策略仍處于臨床前階段，但是可以預(yù)測越來越多的此類技術(shù)將會克服發(fā)展障礙，并在未來的臨床試驗中得到評估，研發(fā)出活性更好且更加長效的蛋白多肽類藥物。