針刺調(diào)控NLRC5抑制NF-κB通路減輕SAMP8小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的研究*

周雅然 ，張雪竹 ，沈鵬

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸部，天津 300381；2．國家中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381；3．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300381；4．天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，天津 300222）

阿爾茨海默?。ˋD）是臨床常見的神經(jīng)變性疾病，病因不清，與β-淀粉樣蛋白沉積（Aβ）、tau蛋白過度磷酸化、氧化應(yīng)激損傷、金屬離子失調(diào)等病理機(jī)制有關(guān)[1]。

NLRC5是NOD樣受體（NLRs）家族成員之一，是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)模式識別受體，分布廣泛，是調(diào)控機(jī)體的先天免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子[2]。研究顯示，NLRC5能負(fù)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）信號通路活性，通過自身寡聚化抑制NF-κB通路上的NF-κB 抑制蛋白激酶（IκK）復(fù)合物磷酸化，從而阻止NF-κB活化，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)，維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用[3]。目前關(guān)于NLRC5的研究，多集中于對機(jī)體外周免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，尚無NLRC5參與調(diào)節(jié)AD腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的報(bào)道。

“調(diào)神益智”針法為石學(xué)敏院士根據(jù)癡呆患者腎精虧虛，腦髓失養(yǎng)的病機(jī)所創(chuàng)立，臨床應(yīng)用該針法能顯著改善血管性癡呆患者的認(rèn)知功能及日常生活能力[4]。該針法對AD模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力也具改善作用[5]，且能減輕AD腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖[6]?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞不僅促進(jìn)Aβ沉積，還能分泌多種炎癥因子和趨化因子形成正反饋級聯(lián)效應(yīng)，加劇AD腦內(nèi)炎癥反應(yīng)[7]。

但目前關(guān)于針刺調(diào)控AD或快速老化小鼠（SAMP8）腦內(nèi)炎癥的研究較少，也未見與NLRC5相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本研究以SAMP8小鼠及其正常同源抗快速老化小鼠R1（SAMRl）作為對照，通過觀察針刺調(diào)控NLRC5對NF-κB通路的影響，從神經(jīng)炎癥角度揭示針刺治療AD的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒、Superscript first strand synthesis system購自Invitrogen公司；SYBR Green real time PCR Master Mix購自TOYOBO公司；DL2000 DNA ladder購自北京天為時代公司；Rnase A（核糖核酸酶A，R-4875）購自Sigma公司；小鼠來源的 NF-кB p65、NLRC5及 HRP標(biāo)記的Actin單克隆抗體、Western Blotting化學(xué)發(fā)光試劑購自Santa Cruz公司；兔來源的Phospho-NF-κB p65（Ser536）（93H1）購自 CST 公司。白介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購自德國IBL公司。

熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（Light Cycler 480，Roche，德國）、酶標(biāo)儀（Elx800，Bio-Tek，美國）、凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDox XRS，Bio-Rad，美國）、凝膠成像分析軟件（Quantity One，Bio-Rad，美國）。

1.2 動物造模與分組 選取健康7月齡雄性SAMP8及其同源正常對照小鼠SAMR1，分為SAMR1組、SAMP8組和SAMP8針刺組，每組10只。動物飼養(yǎng)溫度（23±2）℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境中，自動控制光照循環(huán)12 h光照/12 h黑暗，每周更換鼠籠墊料1次。自由取食和飲水。動物由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供（津?qū)崉淤|(zhì)M準(zhǔn)字第006號，清潔級）。

1.3 治療方法 針刺組采用“調(diào)神益智”針法進(jìn)行治療，取穴為水溝、內(nèi)關(guān)和三陰交。穴位定位參照中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會制定的《動物針灸穴位圖譜》。水溝行雀啄手法10次；內(nèi)關(guān)行捻轉(zhuǎn)瀉法30 s；三陰交行捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法30 s。每日治療1次，持續(xù)30 d，第7天休息1次。

1.4 Morris水迷宮評價認(rèn)知功能 采用Morris水迷宮評價動物認(rèn)知功能，具體方法參考文獻(xiàn)[8]。簡述如下，Morris水迷宮由圓形水池、圓柱形平臺和記錄系統(tǒng)3部分組成。水池直徑90 cm，高50 cm，池壁及池底涂成黑色。水池注水30 cm，水溫為（24±1）℃。隨意將水池分為4個象限；將無色透明的平臺（直徑9 cm，高28 cm）置于任一象限中央，平臺表面沒于水下1 cm。攝像頭置于水池中央的上方約2 m處，采集動物游泳軌跡圖像，由圖像自動采集和分析系統(tǒng)進(jìn)行分析處理。

隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)：將平臺置于第3象限中央，平臺中點(diǎn)距池壁22．5 cm，且位置保持不變。將動物面朝池壁輕輕放入水中，記錄小鼠從入水至找到平臺的游泳軌跡及時間（逃避潛伏期）等。實(shí)驗(yàn)前1 d，讓動物在迷宮中自由游泳以熟悉環(huán)境，上下午各1次，每次時間為60 s。如果60 s內(nèi)找不到平臺，由實(shí)驗(yàn)者將小鼠放到平臺上10 s以熟悉環(huán)境。正式實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠如果在60 s內(nèi)找不到平臺也將其放在平臺上10 s，并將潛伏期記為60 s。此實(shí)驗(yàn)于第1～5天進(jìn)行，上下午各兩次，且入水點(diǎn)隨機(jī)改變，但同1天內(nèi)上下午入水點(diǎn)的次序相同。

空間探索實(shí)驗(yàn)：此實(shí)驗(yàn)于隱蔽實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤除平臺立即進(jìn)行。入水點(diǎn)選取第2象限，游泳時間為60 s，記錄小鼠在原平臺處停留時間以及穿越次數(shù)等。

反向?qū)嶒?yàn)：將平臺置于第1象限中央，平臺中點(diǎn)距池壁22．5 cm，其他條件及方法同隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)。此實(shí)驗(yàn)于第6～8天進(jìn)行。

可視平臺實(shí)驗(yàn)：為排除感覺、視覺或運(yùn)動功能障礙對空間學(xué)習(xí)記憶的影響，第9天進(jìn)行可視平臺實(shí)驗(yàn)。此時平臺高出水面1 cm，并將平臺表面包裹成綠色，其余操作同隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)，上下午各1次。

1.5 RT-PCR法測定NF-κBmRNA等的表達(dá) Trizol法提取海馬組織中總RNA。將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA加入到含有上下游引物、熒光染料SYBR green的25 μL反應(yīng)體系中，qRT-PCR法檢測其中p65、NLRC5基因相對于管家基因GAPDH的表達(dá)情況。引物由上海生工合成，引物序列為：P65，5’-CACCTCAATGGCTACACAGGACCA-3’，5’-ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT-3’；NLRC5，5’-CCTGAACGATGACAGCCTGA，5’-AACAGCATGGCTTAGGGACC-3’；GAPDH，5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，5’-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3’。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 15 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，2-ΔΔCT法分析結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western Blot測定蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取海馬組織總蛋白。蛋白樣品經(jīng)10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印、5%脫脂奶封閉后，分別與總p65（t-p65）、磷酸化 p65（p-p65）、NLRC5（1∶1 000）一抗4℃雜交過夜，后與相應(yīng)二抗雜交、化學(xué)發(fā)光顯色，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析光密度值。每個樣品重復(fù)測量 3次，取均值分析。實(shí)驗(yàn)以 β-actin（1∶1 000）作為內(nèi)參照物。

1.7 ELISA 法檢測 IL-1β、IL-6、TNF-α水平 治療結(jié)束后，將動物處死，分離動物腦內(nèi)海馬組織。依照ELISA試劑盒說明書，于450nm測定其中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，隱蔽平臺和反向平臺實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期比較采用重復(fù)測量方差分析，其他數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用 LSD-t檢驗(yàn)（方差齊時）/Dunnett’s T3法（方差不齊時），P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺對認(rèn)知功能的影響 對隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)的研究表明，SAMR1組的逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸降低；SAMP8組的逃避潛伏期雖隨時間降低，但明顯高于 SAMR1 組（P＜0．01）；針刺組的逃避潛伏期從第 3天起明顯低于 SAMP8 組（P＜0．05），但仍高于SAMR1對照組，見表1。從采用的搜索策略比較，第1天各組動物大多以邊緣式搜索策略尋找水中平臺，少數(shù)SAMR1小鼠能以隨機(jī)式策略發(fā)現(xiàn)平臺。第3天SAMR1和針刺組多能以趨向式策略找到平臺，而SAMP8組的動物中僅部分能以趨向式策略找到平臺，其余則多采取邊緣式或隨機(jī)式策略搜索平臺。第5天SAMR1組和針刺組小鼠多在相對較短時間內(nèi)以趨向式找到平臺，部分表現(xiàn)為直線式；而SAMP8組則仍多以隨機(jī)式和趨向式策略尋找平臺，見圖1。

對空間探索實(shí)驗(yàn)的研究表明，與SAMR1組比較，SAMP8組的首次穿越原平臺時間明顯較長，穿越原平臺次數(shù)較少，中環(huán)區(qū)域停留時間百分比較小（P＜0．05），說明 SAMP8 的記憶保持能力受損。與SAMP8組比較，針刺組首次穿越原平臺時間較短，原平臺位置的穿越次數(shù)較多，中環(huán)區(qū)域停留時間百分比較高（P＜0．05），提示針刺能提高小鼠的記憶保持能力，見表2。對反向平臺實(shí)驗(yàn)的研究表明，SAMP8組逃避潛伏期明顯高于 SAMR1 組（P＜0．05），提示SAMP8存在再學(xué)習(xí)能力的損傷。針刺組逃避潛伏期明顯短于 SAMP8 組（P＜0．05），而與 SAMR1 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），提示針刺能提高 SAMP8 的再學(xué)習(xí)能力，見表3。對可視平臺實(shí)驗(yàn)的研究表明，各組的逃避潛伏期和搜索策略間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），提示感覺或運(yùn)動功能的差異未對其空間學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生影響。

表1 隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of escape latencies in the hidden platform trials（±s）s

表1 隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of escape latencies in the hidden platform trials（±s）s

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與 SAMP8 組比較，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天SAMR1 組 10 33．49±12．89 26．20± 5．76 19．17± 4．06 20．62± 5．74 17．48±11．05 SAMP8 組 10 42．87±11．49** 36．71±14．47** 37．76±14．49** 33．62± 6．80** 32．59± 6．76**針刺組 10 36．10± 9．24* 30．14±11．99* 27．17±13．15*# 29．39±12．04* 25．55±18．90*#

圖1 隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)中搜索策略的變化Fig.1 Changes in search strategy in the hidden platform trials

表2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）Tab.2Comparison of the results in the probe trial（±s）

表2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）Tab.2Comparison of the results in the probe trial（±s）

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0．05；與 SAMP8 組比較，#P＜0．05。

中環(huán)區(qū)域停留時間百分比（%）SAMR1 組 10 12．80± 9．22 4．16±1．07 49．11± 7．71 SAMP8 組 10 29．94±17．19* 1．62±0．58* 29．70± 5．44*針刺組 10 14．31± 9．05*# 3．31±1．14# 43．50±13．12#組別 動物數(shù) 首次穿越原平臺時間（s）原平臺穿越次數(shù)（次）

表3 反向平臺實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期結(jié)果比較（±s）Tab.3 Comparison of escape latencies in the reversal trials（±s）s

表3 反向平臺實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期結(jié)果比較（±s）Tab.3 Comparison of escape latencies in the reversal trials（±s）s

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0．05；與 SAMP8 組比較，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) 第6天 第7天 第8天SAMR1 組 10 43．83± 9．34 28．33± 9．72 28．87±13．47 SAMP8 組 10 44．83±14．34 49．77±10．80* 33．49±10．76*針刺組 10 40．63±12．94 33．89±10．02# 29．13± 9．65#

2.2 針刺對腦內(nèi)NF-κB、NLRC5 mRNA表達(dá)的影響 SAMP8海馬內(nèi)p65 mRNA表達(dá)較SAMR1明顯增高，NLRC5 mRNA表達(dá)較SAMR1顯著降低（P＜0．01）；針刺治療能夠明顯抑制 p65 mRNA 水平，提高NLRC5 mRNA水平，與SAMP8相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見圖 2。

圖2 海馬內(nèi)p65和NLRC5 mRNA的表達(dá)情況（±s）Fig.2 p65 and NLRC5 mRNA expression level in the hippocampus（±s）

2.3 針刺對NF-κB、NLRC5通路蛋白表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果表明，各組β-actin表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示各組上樣量均等。SAMP8海馬內(nèi) t-p65、p-p65、p-IκK 表達(dá)較 SAMR1 升高，NLRC5較SAMR1降低，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。針刺治療后，針刺組 t-p65、p-p65、p-IκK表達(dá)明顯下調(diào)，NLRC5表達(dá)上調(diào)，與SAMP8比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見圖3。

圖3 NLRC5、NF-κB通路蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Expression of NLRC5，NF-κB pathway proteins

2.4 針刺對海馬內(nèi) IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 SAMP8 海馬內(nèi) IL-1β、IL-6、TNF-α 水平較SAMR1顯著增高（P＜0．05 或 P＜0．01）；針刺能夠降低上述炎癥因子水平，特別是IL-6降低明顯，與SAMP8相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且明顯高于SAMR1（P＜0．05），見表 4。

表4 海馬內(nèi) IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（±s）Tab.4 IL-1β，IL-6，TNF-α levels in the hippocampus（±s）pg/g

表4 海馬內(nèi) IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（±s）Tab.4 IL-1β，IL-6，TNF-α levels in the hippocampus（±s）pg/g

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與 SAMP8 組比較，#P＜0．05。

組別 動物數(shù) IL-1β IL-6 TNF-α SAMR1 組 10 54．18±22．61 296．85± 48．42 64．52±21．36 SAMP8 組 10 88．19±29．38*563．16±150．06**98．41±35．52*針刺組 10 78．29±26．43 469．09± 73．23*#76．66±24．80*

3 討論

AD是衰老相關(guān)疾病。隨著衰老，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高而蛋白質(zhì)錯誤折疊的修復(fù)能力下降，均導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性損傷增多，以致Aβ沉積增加。研究顯示，Aβ具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)DNA損傷和神經(jīng)元凋亡的作用[9]，Aβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)其釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子。炎癥因子水平增高不僅加速了Aβ沉積[10]，還可持續(xù)激活NF-κB通路。NF-κB通路的活化可促進(jìn)多種炎癥遞質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，由此造成AD腦內(nèi)正反饋式的瀑布級聯(lián)效應(yīng)，導(dǎo)致慢性持續(xù)性神經(jīng)炎癥反應(yīng)，引起AD漸進(jìn)性神經(jīng)損傷[11]。

NLRC5是調(diào)控機(jī)體的先天免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子。NLRC5能負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路活性，通過自身寡聚化抑制NF-κB通路上的IкK復(fù)合物磷酸化，從而抑制NF-κB的核移位，從轉(zhuǎn)錄水平抑制NF-κB信號通路活性，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)，維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用[12]。敲除NLRC5基因或減少其表達(dá)后，NF-κB 活性相應(yīng)提高，且 TNF-α、IL-6 和 IL-1β等炎癥因子強(qiáng)烈表達(dá)[13]。最近的證據(jù)表明，NLRC5通過Toll樣受體（TLR）信號通路來負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB的激活[14]。

臨床研究證實(shí)，針刺治療輕中度AD有一定效果，能改善患者的認(rèn)知功能、日常生活活動能力、神經(jīng)精神癥狀和總體功能，特別在日常生活活動能力、神經(jīng)精神癥狀和總體功能方面優(yōu)于臨床常用西藥安理申，且安全性、耐受性良好[15]。但目前關(guān)于針刺調(diào)控AD腦內(nèi)炎癥的研究較少，也未見與NLRC5相關(guān)的研究報(bào)道。有關(guān)血管性癡呆的研究表明，針刺可使大鼠海馬缺血區(qū)p65和IL-1β、TNF-α表達(dá)降低，阻滯活化的NF-кB進(jìn)入細(xì)胞核，抑制NF-кB信號通路的傳導(dǎo)，減少炎性細(xì)胞因子的釋放，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用[16-17]。

石學(xué)敏院士根據(jù)AD腎精虧虛，腦髓失養(yǎng)的病機(jī)，創(chuàng)立“調(diào)神益智”針法。其中，水溝居于督脈，督脈為陽脈之海，主一身之陽，與腦關(guān)系密切，水溝為督脈與手足陽明經(jīng)之交會穴，性善啟閉開竅，有開竅醒神之功，為調(diào)神之要穴；內(nèi)關(guān)為心包經(jīng)絡(luò)穴，可清心開竅；三陰交為足厥陰肝經(jīng)、足太陰脾經(jīng)、足少陰腎經(jīng)之交會，有補(bǔ)腎滋陰生髓的功能。3穴合用，可達(dá)到補(bǔ)腎填精、調(diào)神益智的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與SAMR1組比較，SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損，NF-κB 通路中 p-IκK、p-p65表達(dá)上升，而 NLRC5表達(dá)下降，提示SAMP8認(rèn)知下降與腦內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有一定相關(guān)性。針刺組的水迷宮成績明顯優(yōu)于SAMP8組，針刺能明顯下調(diào)NF-κB通路中p-IκK、p-p65的表達(dá)，而提高NLRC5表達(dá)。提示SAMP8鼠腦內(nèi)存在NF-κB通路激活現(xiàn)象，針刺能通過提高NLRC5來抑制IκK激酶磷酸化，從而減弱NF-κB的活化，減少炎癥因子釋放，緩解SAMP8小鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，改善SAMP8小鼠認(rèn)知障礙。

4 小結(jié)

SAMP8鼠腦內(nèi)存在炎癥反應(yīng)激活現(xiàn)象，針刺能通過提高NLRC5來抑制NF-κB的活化，減少炎癥因子釋放，降低腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而改善神經(jīng)元存活微環(huán)境，進(jìn)而改善SAMP8小鼠的認(rèn)知障礙。