外泌體miRNA在胰腺癌中的功能及臨床價(jià)值研究進(jìn)展

秦雯，楊建宇，黃夏寧，賴曉玉，朱小東

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院 a.病理科，b.腫瘤科，南寧 530199)

胰腺癌是一種侵襲性疾病，缺乏早期生物標(biāo)志物、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、化療效果差，也是導(dǎo)致全球癌癥死亡的五大主要原因之一[1-2]。胰腺癌生存率低與其高侵襲性、固有的化療耐藥和缺乏有效的靶向治療藥物有關(guān)。有證據(jù)表明，高侵襲性和耐藥性與腫瘤微環(huán)境的改變關(guān)系密切，腫瘤微環(huán)境的特征是通過自分泌、旁分泌或細(xì)胞間直接接觸來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的通訊[3]。然而，細(xì)胞間也可以通過其他機(jī)制進(jìn)行通訊，如外泌體。腫瘤分泌的外泌體是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵媒介[4]。癌細(xì)胞的外泌體含有更多的微RNA(microRNA，miRNA)，其中也包括與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物相關(guān)的miRNA[5-8]。上述研究提示，腫瘤細(xì)胞可能通過外泌體途徑調(diào)控局部腫瘤微環(huán)境甚至遠(yuǎn)隔組織中靶細(xì)胞的行為。有研究證實(shí)，外泌體在腫瘤的局部侵襲、遷移、血管生成、免疫逃避和治療耐藥中均發(fā)揮重要作用[9-12]。此外，由于大多數(shù)細(xì)胞能分泌外泌體，使外泌體在血液和其他體液中廣泛存在，因此在腫瘤領(lǐng)域關(guān)于外泌體的臨床應(yīng)用研究也越來越多，包括用微創(chuàng)取樣手段獲取外泌體RNA作為診斷和判斷腫瘤預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物、利用外泌體作為蛋白質(zhì)和核酸的天然載體進(jìn)行治療[13-14]等。有學(xué)者通過生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與胰腺癌相關(guān)的外泌體miRNA主要有19個(gè)：miR-100、miR-10b、miR-125B1、miR-145、miR-155、miR-196A1、miR-200A、miR-200C、miR-203A、miR-21、miR-210、miR-212、miR-221、miR-222、miR-23B、miR-126、miR-141、miR-373和miR-375[15]?，F(xiàn)就外泌體miRNA在胰腺癌中的研究進(jìn)展予以綜述，以期為胰腺癌的診斷和治療提供新思路。

1 外泌體miRNA的概述

在人類幾乎所有細(xì)胞類型中均存在囊泡內(nèi)或與囊泡相關(guān)的功能RNA，這引起了人們對細(xì)胞外囊泡，尤其是外泌體的廣泛關(guān)注。外泌體是脂質(zhì)雙分子層結(jié)合形成的納米囊泡。外泌體通常以其大小(40～100 nm)來描述，代表其起源的表面標(biāo)志物和分子內(nèi)容物是其本質(zhì)所在[16-17]。Pan和Johnstone[18]在綿羊網(wǎng)狀細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中觀察核內(nèi)體的出芽，第一次描述了外泌體，并發(fā)現(xiàn)由此產(chǎn)生的多泡體通過與質(zhì)膜融合形成在細(xì)胞外釋放的外泌體，而這一生物過程可將外泌體與胞外囊泡家族的其他成員區(qū)分開來[19]，并且外泌體的組裝和運(yùn)輸是在核內(nèi)分選復(fù)合體的嚴(yán)格控制下進(jìn)行的[20]。此外，不同外泌體所含的分子物質(zhì)(即外泌體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分)與外泌體所在的母細(xì)胞明顯不同，表明外泌體有獨(dú)特的生理功能[21-23]。其中外泌體中的核酸性質(zhì)較穩(wěn)定且具有特異性，在疾病的研究中具有重要意義。這些核酸包括信使RNA、miRNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、小干擾RNA等，其中比較重要的是miRNA[24-25]，外泌體中的miRNA參與干細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、血管形成、蛋白修飾等過程，因此與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

2 外泌體miRNA與胰腺癌的診斷

盡管在發(fā)展成浸潤性癌前有一個(gè)潛伏期，但目前仍未在此“潛伏期”內(nèi)找到特異性生物標(biāo)志物用于胰腺癌的早期篩查和診斷。大多數(shù)患者確診時(shí)已為胰腺癌晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，喪失了最佳的治療時(shí)機(jī)。因此，尋找適合胰腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物具有重要意義。近年來，外泌體miRNA成為許多學(xué)者尋找胰腺癌早期診斷生物標(biāo)志物的著眼點(diǎn)。外泌體具有以下優(yōu)點(diǎn)：①體內(nèi)游離分子在細(xì)胞外會迅速分解，而外泌體能以一種相對穩(wěn)定的形式在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)的生物分子。②廣泛存在于體液中，取樣簡單、價(jià)廉且為非侵入性，基本上無風(fēng)險(xiǎn)。③外泌體是反映腫瘤細(xì)胞獨(dú)特分子機(jī)制的窗口，其內(nèi)攜帶大量核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分，均可能成為潛在的生物標(biāo)志物用于胰腺癌的早期篩查和診斷。這些成分中核酸性質(zhì)較穩(wěn)定且具有特異性，其中miRNA適宜作為候選生物標(biāo)志物。④外泌體中的miRNA高度富集。

Goto等[26]將29例胰腺中重度導(dǎo)管不典型增生患者、32例胰腺癌患者和22例正常人血清中的外泌體miRNA進(jìn)行對比研究，用二代測序的方法分析三組人群外泌體miRNA的變化。結(jié)果顯示，在胰腺中重度導(dǎo)管不典型增生和胰腺癌患者中血清外泌體miR-191、miR-21、miR-451a水平均顯著升高，說明這三項(xiàng)指標(biāo)在胰腺癌及其癌前病變中均呈升高趨勢，可能成為胰腺癌早期診斷的候選生物標(biāo)志物。但上述研究發(fā)現(xiàn)三組人群間循環(huán)miR-191、miR-21、miR-451a水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在胰腺癌的早期診斷中外泌體miRNA可能較循環(huán)miRNA更適合作為生物標(biāo)志物。目前公認(rèn)的胰腺癌診斷的生物標(biāo)志物只有癌胚抗原和糖類抗原19-9，然而兩者僅在晚期胰腺癌中升高。上述研究中的三組人群以血清癌胚抗原和糖類抗原19-9水平作為參照，利用受試者工作特征曲線分別分析外泌體miR-191、miR-21和miR-451a的診斷效能，發(fā)現(xiàn)這3種外泌體miRNA均可能成為胰腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。

2.1外泌體miR-191 miR-191是一種由22個(gè)堿基組成的非編碼RNA。miR-191及其宿主基因含反密碼子結(jié)合域3在人類第3號染色體短臂上，基因定位為3p21.31。外泌體miR-191在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，被認(rèn)為是致癌基因。在肝癌中，miR-191可抑制T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3的表達(dá)，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，進(jìn)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生[27]；在胃癌中，miR-191可作用于靶基因N-去乙?；?N-磺基轉(zhuǎn)移酶1，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長并抑制其凋亡。在胰腺癌慢性缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，可在miR-191的5′端側(cè)面區(qū)域與缺氧反應(yīng)元素5結(jié)合并啟動miR-191的轉(zhuǎn)錄，使miR-191在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯升高，使胰腺癌細(xì)胞外泌體中的miR-191隨之升高。外泌體miR-191可以調(diào)控細(xì)胞的侵襲和分化，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤密切相關(guān)，可能成為胰腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物[28]。

2.2外泌體miR-21 miR-21定位于17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)域上，部分與液泡膜蛋白1基因存在重疊編碼，因此其表達(dá)水平增高與腫瘤的發(fā)生有一定關(guān)系。此外，17q染色體區(qū)域的擴(kuò)增與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。外泌體miR-21在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、髓母細(xì)胞瘤、胰腺癌等惡性腫瘤中被證實(shí)為致癌基因，其表達(dá)增加將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[29]。外泌體miR-21常以腫瘤抑制基因?yàn)榘谢?，通過下調(diào)靶基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[30]。這些靶基因包括異質(zhì)核糖核酸蛋白K、程序性死亡蛋白4、金屬蛋白酶組織抑制物-3、腫瘤相關(guān)蛋白63等。在胰腺癌中，外泌體miR-21通過下調(diào)靶基因程序性死亡蛋白4、金屬蛋白酶組織抑制物-3等腫瘤抑制基因，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致胰腺癌的惡化。反之，在小鼠移植瘤模型中，抑制miR-21的表達(dá)不利于腫瘤細(xì)胞的存活和腫瘤的生長。臨床研究發(fā)現(xiàn)，miR-21水平在侵襲性的胰腺腫瘤組織中最高，非侵襲性的胰腺腫瘤組織中次之，正常胰腺組織中最低，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，外泌體miR-21可能成為胰腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。

2.3外泌體miR-451a miR-451a定位于染色體17q11.2上。目前miR-451a在人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。大部分研究(如對卵巢癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸部鱗癌的研究)提示miR-451a是抑癌基因[31-32]，少數(shù)研究(如對膠質(zhì)瘤等的研究)提示其有促癌作用[33]。如低miR-451表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者較短的總生存期相關(guān)；在動物實(shí)驗(yàn)中，miR-451可通過增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，顯著抑制裸鼠非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外增殖、集落形成和腫瘤的發(fā)生[31]。而在膠質(zhì)瘤中結(jié)論相反，miR-451促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。因此，miR-451a對胰腺癌的作用及其是否適合作為胰腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物還需要更多的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

3 外泌體miRNA與胰腺癌的治療

細(xì)胞毒素常規(guī)用于可手術(shù)切除或不可手術(shù)切除胰腺癌患者的治療，然而僅有少數(shù)患者對治療有反應(yīng)；對其他治療方法進(jìn)行大量探索后仍難以找到對胰腺癌行之有效的治療方法。如吉西他濱和基于吉西他濱的聯(lián)合化療是胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)療法，但僅對24%的患者有效，且中位生存時(shí)間僅5～7個(gè)月[34-36]。深入研究外泌體miRNA可能為胰腺癌的治療提供新思路。

3.1外泌體miR-125b miR-125b包括miR-125b-1和miR-125b-2，其中染色體11q23位點(diǎn)形成miR-125b-1，染色體21q2位點(diǎn)形成miR-125b-2。miR-125b能激活免疫細(xì)胞，主要表現(xiàn)：①巨噬細(xì)胞中若miR-125b過表達(dá)，則可抑制干擾素調(diào)節(jié)因子4的表達(dá)，從而強(qiáng)化巨噬細(xì)胞的免疫能力；②miR-125b可調(diào)控免疫系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如調(diào)控T淋巴細(xì)胞中ETS-1(ETS proto-oncogene 1)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Su等[37]使用納米顆粒運(yùn)載系統(tǒng)將miR-125b-2轉(zhuǎn)染給胰腺癌細(xì)胞株(Panc 1)，并將其與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞株分泌的外泌體成分發(fā)生改變，富于miR-125b-2；外泌體中的miR-125b-2通過細(xì)胞間通訊機(jī)制作用于共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞由M2型變?yōu)镸1型(也稱為經(jīng)典的活化巨噬細(xì)胞)，從而獲得更強(qiáng)的免疫功能，改變腫瘤的微環(huán)境，發(fā)揮抗腫瘤的作用。因此，選擇性調(diào)控胰腺癌細(xì)胞外泌體內(nèi)容物中的miRNA(如miR-125b-2)，可能通過免疫途徑實(shí)現(xiàn)胰腺癌的基因治療。

3.2外泌體miR-146a miR-146a基因定位于第5號染色體LOC285628基因的第二個(gè)外顯子區(qū)(Chr.5q34)。前體miR-146a具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，靠近5′端被加工成熟即為has-miR-146a-5p，簡稱miR-146a。miR-146a主要調(diào)節(jié)免疫和炎癥，但也參與腫瘤的調(diào)控。在纖維間質(zhì)比較稠密、成纖維細(xì)胞數(shù)目超過上皮細(xì)胞數(shù)目的胰腺癌患者中常發(fā)生化療耐藥。這是因?yàn)槟[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，使其免于細(xì)胞毒性化療藥物(如吉西他濱)的殺傷。在用吉西他濱進(jìn)行治療時(shí)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞會產(chǎn)生含有大量miR-146a的外泌體，后者使吉西他濱抵抗蛋白大量產(chǎn)生，因此導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的廣泛耐藥。Massoumi等[38]在體外實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合使用外泌體釋放抑制劑和吉西他濱作用于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其無法誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥，最終導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的存活率降低。因此，局部使用外泌體釋放抑制劑能間接減少來自外泌體的miRNA，可能有助于胰腺癌的治療。

4 外泌體miRNA與胰腺癌的預(yù)后

與其他惡性腫瘤一樣，在胰腺癌中，外泌體通過轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA引起遠(yuǎn)隔細(xì)胞之間遺傳信息的交流，從而造成受體細(xì)胞遺傳信息的變化，促進(jìn)腫瘤增殖，并進(jìn)一步引起腫瘤細(xì)胞耐藥、免疫逃逸等現(xiàn)象，從而影響胰腺癌預(yù)后。例如，化療耐藥胰腺癌細(xì)胞可通過外泌體miRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)，將化療耐藥性從化療耐藥胰腺癌細(xì)胞傳播給化療敏感胰腺細(xì)胞，從而引起胰腺癌細(xì)胞的廣泛耐藥[39]。外泌體miRNA通過阻礙淋巴細(xì)胞的活化、降低其功能等多種機(jī)制造成胰腺癌細(xì)胞的免疫逃逸。

4.1外泌體miR-155 miR-155基因定位于染色體21q21，屬于B細(xì)胞整合簇基因，由其第3個(gè)外顯子內(nèi)的高度保守區(qū)域編碼。miR-155可由活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等產(chǎn)生，其表達(dá)水平主要受B細(xì)胞整合簇基因的轉(zhuǎn)錄情況影響。若B細(xì)胞整合簇基因過表達(dá)，則miR-155的表達(dá)水平也相應(yīng)升高，從而促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖。大量研究表明，miR-155的表達(dá)和功能異常與胰腺癌的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)[40]。目前認(rèn)為其可能的機(jī)制主要包括：①miR-155可抑制叉頭框蛋白O3a轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并降低超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的水平，因此顯著提高胰腺癌細(xì)胞的增殖能力；②miR-155可抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3基因的表達(dá)，同時(shí)增加Janus激酶2和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3基因的表達(dá)，從而提高胰腺癌細(xì)胞的增殖能力、減少胰腺癌細(xì)胞的凋亡；③miR-155可以抑制吉西他濱代謝的關(guān)鍵酶，并通過外泌體從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)運(yùn)，使其在胰腺癌細(xì)胞間交換，從而導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的普遍耐藥[41]。

4.2外泌體miR-212 miR-212基因定位于染色17p13.3，其表達(dá)異常與結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在胰腺癌中，miR-212的表達(dá)顯著升高。在胰腺癌中，外泌體miR-212能特異性地下調(diào)樹突狀細(xì)胞中的調(diào)控因子X相關(guān)蛋白，而調(diào)控因子X相關(guān)蛋白是形成主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。調(diào)控因子X相關(guān)蛋白的下調(diào)導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ的轉(zhuǎn)錄減少，直接影響樹突狀細(xì)胞將抗原呈遞給T細(xì)胞的能力，即導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞的抑制[38]和胰腺癌細(xì)胞的免疫逃逸。

4.3外泌體miR-203 miR-203位于染色體14q32.33位點(diǎn)，此位點(diǎn)屬于不穩(wěn)定脆性區(qū)域。在RNA聚合酶的作用下，細(xì)胞核內(nèi)的RNA首先形成轉(zhuǎn)錄原始體(pri-miR-203)。該轉(zhuǎn)錄原始體在Drosha酶的作用下被剪切成發(fā)夾狀的miRNA前體(pre-miR-203)。miR-203前體被miRNA運(yùn)輸?shù)鞍?轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，隨后經(jīng)過剪切、解離以及不成熟的反義鏈降解消失等步驟，最終形成成熟的miR-203。在胰腺癌中，外泌體來源的miR-203既能降低Toll樣受體4的表達(dá)，也能減少細(xì)胞因子的表達(dá)(如樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-12)；而采用miR-203缺失的外泌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則得到相反的結(jié)果[39]。說明外泌體miR-203可能導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞的功能降低，從而進(jìn)一步引起胰腺癌細(xì)胞的免疫逃逸。

4.4外泌體miR-196a miR-196a基因含兩個(gè)亞型，其中miR-196a-1基因位于染色體17q21.32上同源盒基因(homeobox genes,HOX)B9和HOXB10基因之間的位點(diǎn)，miR-196a-2基因位于染色體12q13.13上HOXC10和HOXC9之間的位點(diǎn)。位于微小雜合性缺失區(qū)、微小擴(kuò)增區(qū)、斷點(diǎn)區(qū)等不穩(wěn)定位點(diǎn)的miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。HOX家族的基因座屬于不穩(wěn)定位點(diǎn)，因此位于其上的miR-196a基因與腫瘤關(guān)系密切，可能具有促進(jìn)腫瘤生長和抗凋亡的功能。外泌體miR-196a的表達(dá)與胰腺癌的臨床病理分期和生存期密切相關(guān)，使其成為胰腺癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物。與Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌患者相比，Ⅲ、Ⅳ期胰腺癌患者外泌體中miR-196a升高的比例更高[38]。此外，外泌體miR-196a水平還與胰腺癌患者的生存期呈負(fù)相關(guān)[15]。

5 結(jié) 語

胰腺癌是一種缺乏早期診斷生物標(biāo)志物、治療難度較大、預(yù)后不良的高度惡性腫瘤。近年來對外泌體miRNA的廣泛研究為胰腺癌的診療提供了新思路。外泌體miRNA是體內(nèi)miRNA存在的一種重要形式。由于外泌體中含有高度富集、穩(wěn)定存在的miRNA，使其在胰腺癌的診斷、治療和預(yù)后中具有重要的臨床意義。外泌體miRNA一方面可能為胰腺癌的早期診斷提供潛在生物標(biāo)志物，另一方面可能為胰腺癌的治療提供新方法。如以外泌體為載體攜帶腫瘤抑制性miRNA，或抑制含腫瘤促進(jìn)性miRNA外泌體的釋放，均有可能達(dá)到提高胰腺癌療效的目的。此外，外泌體miRNA還可能通過預(yù)測腫瘤的耐藥性和免疫逃逸情況，為胰腺癌的預(yù)后提供判斷依據(jù)。