無長突細胞的分化調(diào)控及其在眼科疾病中的研究進展

吳夢娟，沈吟

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心，武漢 430060)

無長突細胞(amacrine cell，AC)是視網(wǎng)膜中亞型最為多樣化的抑制性中間神經(jīng)元，也是視覺系統(tǒng)中第一個觸發(fā)動作電位的神經(jīng)元，主要位于視網(wǎng)膜淺層，與雙極細胞和神經(jīng)節(jié)細胞形成突觸連接，合成和分泌多巴胺、甘氨酸、γ-氨基丁酸和乙酰膽堿等多種神經(jīng)遞質(zhì)[1]。研究表明，AC分泌的神經(jīng)遞質(zhì)不僅可以促進視網(wǎng)膜細胞的生長發(fā)育，還可通過細胞間的突觸連接傳遞視覺信號，調(diào)控神經(jīng)節(jié)細胞的方向性、視敏度及晝夜節(jié)律等[2-4]。盡管目前對AC發(fā)育和功能的研究取得了顯著進展，但其結(jié)構(gòu)和功能紊亂仍是影響正常視功能的主要原因。

目前研究認為，在內(nèi)源性調(diào)控因子的作用下，視網(wǎng)膜AC前體細胞可定向分化為40多種形態(tài)、位置、生理特性和功能各不相同的亞型[5]。因此，內(nèi)源性調(diào)控因子的表達水平與AC的定向分化密切相關(guān)。研究顯示，除調(diào)控視網(wǎng)膜細胞發(fā)育、電信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等正常生理功能外，AC還參與了諸多眼科疾病的發(fā)生發(fā)展，如近視[6]、孔源性視網(wǎng)膜脫離[7]、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)[8]、青光眼[9]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[10]、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)視網(wǎng)膜病變[11]和先天性眼球震顫[12]等。一直以來，國內(nèi)外相繼開展了許多有關(guān)AC的研究?，F(xiàn)對國內(nèi)外AC的研究成果，從分類上總結(jié)和概述AC的分化調(diào)控及相關(guān)眼科疾病的研究進展。

1 AC的分類

近年來，隨著科學(xué)家對AC研究的不斷深入，其分類方法呈現(xiàn)多樣化，不同研究的結(jié)論也不同。早期，Gajal通過高爾基體銀染法首次發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜有多種AC[13]；隨后，科學(xué)家們根據(jù)樹突的分布范圍及分層特點將AC分為多種亞型。在此基礎(chǔ)上，Macosko等[14]利用Drop-seq測序方法進一步確定了21種AC。雖然AC分類的方法有多種，但目前應(yīng)用最廣泛的是依據(jù)神經(jīng)遞質(zhì)的類型將其分為三大類[5]：γ-氨基丁酸類無長突細胞(GABAergic amacrine cell，GABAergic AC)、甘氨酸類無長突細胞(glycinergic amacrine cell，Glycinergic AC)以及不分泌γ-氨基丁酸和甘氨酸類無長突細胞(non-GABAergic-non-glycinergic amacrine cell，nGnG AC)。前兩者是AC的主要類型，各占40%左右[15]。再結(jié)合細胞內(nèi)特異表達的神經(jīng)遞質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子，可進一步細分為其他類型，見表1。

表1 視網(wǎng)膜AC的常見分類及標(biāo)志物

2 AC定向分化的調(diào)控因子

調(diào)控因子是AC發(fā)育異常的重要因素，主要包括內(nèi)源性調(diào)控因子和外源性調(diào)控因子，其中，內(nèi)源性調(diào)控因子的時空特異性決定了AC發(fā)生、分化及成熟。由于AC分化的復(fù)雜性，同一因子可調(diào)控一類或多類AC，如轉(zhuǎn)錄因子Barhl2[27-28]、Bhlhb5[29]和Ptf1a[30]不僅調(diào)控GABAergic AC和Glycinergic AC分化，后兩者還參與了雙極細胞、水平細胞的形成。此外，磷酸酶Pten也可通過蛋白激酶B、轉(zhuǎn)化生長因子和胞外信號調(diào)節(jié)激酶等信號通路，影響上述三大類AC的分化[31]?，F(xiàn)分別概述與GABAergic AC、Glycinergic AC以及nGnG AC分化密切相關(guān)的調(diào)控因子，見圖1。

GABAergic：γ-氨基丁酸類；Glycinergic：甘氨酸類；nGnG：不分泌γ-氨基丁酸和甘氨酸類；Ap-2α：轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白2α；Sox2：性別決定區(qū)Y框蛋白2；Islet1：胰島素基因增強結(jié)合蛋白1；Nr2cl(Tr2)：核激素受體(睪丸受體2)；Nr4a2：核受體亞家族4A組成員2；LHX9：LIM-同源異形框9；CPEB3：胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白3；Barhl2：BarH樣同源框蛋白2；Bhlhb5：堿性螺旋環(huán)螺旋域蛋白5；Ptf1a：胰腺相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1a；Pten：磷酸酶與張力蛋白同源物；Pax6：同源異型基因6；NeuroD2：神經(jīng)源性分化蛋白2；Prdm13：PR結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白13；Satb2：特異AT序列結(jié)合蛋白2；NeuroD6：神經(jīng)源性分化蛋白6

2.1調(diào)控GABAergic AC分化的因子 GABAergic AC是視網(wǎng)膜上最早分化的一類AC。盡管膽堿類、多巴胺類、神經(jīng)性一氧化氮類AC均屬于GABAergic AC，但調(diào)控其分化的因子各不相同。經(jīng)研究，轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白2α的水平與GABAergic AC分化呈負相關(guān)，條件性敲除轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白2α基因，GABAergic AC增多[32]；而轉(zhuǎn)錄因子性別決定區(qū)Y框蛋白2表達過多或過少均可影響GABAergic AC的分化[20]。另外，Elshatory等[33]和Olivares等[34]研究發(fā)現(xiàn)，同源結(jié)構(gòu)域蛋白Islet1和核激素受體基因Nr2c1(Tr2)可正向調(diào)控膽堿類AC分化。而RNA結(jié)合蛋白胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白3缺失僅引起膽堿類AC一過性增多，成年后又恢復(fù)正常水平[35]。為了研究孤兒核受體Nr4a2在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的作用，Jiang和Xiang[21]通過轉(zhuǎn)基因小鼠及視網(wǎng)膜外植體培養(yǎng)技術(shù)檢測Nr4a2在視網(wǎng)膜中的表達及生物學(xué)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶向失活Nr4a2可導(dǎo)致多巴胺類AC缺失，反之，可促進GABAergic AC的分化，提示Nr4a2在這兩類AC分化過程中所參與的調(diào)控機制可能不同。此外，Balasubramanian等[24]利用他莫昔芬誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子LIM-同源異形框9缺失的小鼠發(fā)現(xiàn)，LIM-同源異形框9是神經(jīng)性一氧化氮類AC分化的重要調(diào)控因子。

2.2調(diào)控Glycinergic AC分化的因子 除Barhl2、Bhlhb5、Ptf1a、Pten等調(diào)控因子參與Glycinergic AC分化外，轉(zhuǎn)錄因子Pax6、NeuroD2以及Prdm13也參與了此類AC的形成。Marquardt等[36]發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜發(fā)育早期缺失Pax6，則Glycinergic AC分化異常；隨后，Remez等[17]也得出了相同結(jié)論。另外，Cherry等[23]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子NeuroD2失活僅影響NeuroD2陽性Glycinergic AC的分化，對陰性表達AC無明顯作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Ebf類AC僅受轉(zhuǎn)錄因子Prdm13的調(diào)控[37]。

2.3調(diào)控nGnG AC分化的因子 nGnG AC是視網(wǎng)膜AC中最少的一類。特異性表達此類AC中的轉(zhuǎn)錄因子Satb2和NeuroD6與其分化密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NeuroD6的水平與nGnG AC的分化呈正相關(guān)，而Satb2又可促進下游NeuroD6的表達[26]。因此，Satb2和NeuroD6可直接或間接調(diào)控nGnG AC的分化。

3 AC與眼科疾病

AC分泌的多巴胺、甘氨酸、γ-氨基丁酸和乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)，在復(fù)雜的視覺成像中發(fā)揮不可替代的作用[38]。目前，臨床上暫無有效的非侵入性儀器檢測AC結(jié)構(gòu)和功能的改變，因此，對于AC的研究僅限于針對某種疾病的回顧性分析或利用基因敲除動物的基礎(chǔ)研究。有證據(jù)表明，AC不僅參與了與多巴胺代謝相關(guān)的眼科疾病，如近視、孔源性視網(wǎng)膜脫離、RP；還與青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變等致盲性眼病的發(fā)生發(fā)展，甚至與先天性眼球震顫等遺傳性眼病密切相關(guān)。

3.1AC在多巴胺代謝相關(guān)眼科疾病中的研究 多巴胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，在記憶、注意力、運動和感覺處理中起主要作用。研究證實，多巴胺不僅存在于大腦中，還表達于視網(wǎng)膜中，主要由多巴胺能AC以旁分泌的方式釋放，擴散至其他視網(wǎng)膜細胞。在視網(wǎng)膜中，多巴胺不僅是明適應(yīng)的化學(xué)遞質(zhì)，調(diào)控和編碼視覺信號[39]；還是視網(wǎng)膜的營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜細胞的生長、發(fā)育[6]。此外，多巴胺還與某些疾病密切相關(guān)，如近視、孔源性視網(wǎng)膜脫離、RP、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)和PD視網(wǎng)膜病變。

3.1.1近視 近視是全球范圍內(nèi)青少年視力下降的常見病因，不僅導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，還會引起焦慮或抑郁[40]。目前，導(dǎo)致近視的病理機制尚未完全明確。自Stone等[41]首次提出“多巴胺可能參與了近視發(fā)展” 的假設(shè)以來，多巴胺的代謝與屈光系統(tǒng)之間的關(guān)系越來越引人注目。在動物實驗中，Wang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜內(nèi)多巴胺的分泌和代謝與光照波長存在明顯依賴性，且多巴胺的含量與眼軸的生長呈負相關(guān)。此外，Landis等[43]實驗證實，增加內(nèi)源性多巴胺的含量可降低小鼠近視的易感性。一些臨床研究也顯示，有效促進多巴胺的分泌可減緩近視的發(fā)展，如Spillmann[44]的一項突破性研究發(fā)現(xiàn)，增加戶外活動時間，近視的發(fā)生率可降低一半。此外，Gong等[45]對3 137例近視患者的臨床資料進行分析發(fā)現(xiàn)，低濃度(0.01%)的阿托品可減緩近視的進展。而低濃度阿托品和強光光照均是促進多巴胺釋放的有效方式。因此，對近視進行早期預(yù)防和早期治療，促進眼內(nèi)多巴胺的分泌，可明顯減少近視的發(fā)生發(fā)展。

3.1.2孔源性視網(wǎng)膜脫離 孔源性視網(wǎng)膜脫離通常是其他眼科疾病的并發(fā)癥，病理上出現(xiàn)神經(jīng)視網(wǎng)膜與色素上皮層分離，嚴(yán)重時視網(wǎng)膜細胞和色素上皮細胞發(fā)生變性、萎縮，導(dǎo)致不可逆的視力受損。Kranias和Dobbie[46]首次在視網(wǎng)膜脫離患者的視網(wǎng)膜下腔及房水中發(fā)現(xiàn)了多巴胺、組胺、乙醇胺等7種胺類物質(zhì)。另有研究發(fā)現(xiàn)，眼內(nèi)多巴胺可與色素上皮細胞表面的D5受體結(jié)合，調(diào)控環(huán)腺苷酸的表達，從而介導(dǎo)細胞的凋亡[47-48]。一項臨床研究也發(fā)現(xiàn)，孔源性視網(wǎng)膜脫離患者眼內(nèi)多巴胺的含量較患有其他視網(wǎng)膜疾病(如玻璃體積血和黃斑皺褶)的同齡對照者明顯升高；另外，患者術(shù)后最佳矯正視力與眼內(nèi)多巴胺含量呈顯著正相關(guān)[7]。這些結(jié)果均表明，多巴胺可能在孔源性視網(wǎng)膜脫離的發(fā)病機制和視網(wǎng)膜細胞的損失中具有重要作用。

3.1.3RP RP是以進行性光感受器細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞功能喪失為特點的遺傳性眼病。雖然RP的致病機制尚未完全明確，但氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、營養(yǎng)因子缺乏可能促進RP的發(fā)生發(fā)展。在動物實驗中，AC的形態(tài)和功能在光感受器細胞受損前就已發(fā)生明顯改變[8]，且受損的多巴胺類AC可發(fā)生自發(fā)性氧化產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)——氧自由基，激發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮細胞損傷[49-50]。目前暫不清楚多巴胺的改變是否會引起視網(wǎng)膜退化，但早期多巴胺類AC結(jié)構(gòu)和功能的改變可推動RP的發(fā)生和不斷演化。

3.1.4ROP ROP是早產(chǎn)兒氧療時出現(xiàn)的視網(wǎng)膜缺血、缺氧，并伴血管異常增生的一種眼科疾病，預(yù)后往往伴有近視、視力減退、視野缺損等。在動物實驗中，氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型被廣泛用于ROP的研究。Spix等[51]通過檢測氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜內(nèi)多巴胺的含量及細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜中的多巴胺含量及多巴胺類AC數(shù)量均較正常同齡小鼠視網(wǎng)膜對照組明顯減少。此外，多巴胺類AC更易受缺血、缺氧引起的氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激的損傷[52]。

3.1.5PD視網(wǎng)膜病變 PD是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性缺失為特征的慢性神經(jīng)退行性疾病。Biehlmaier等[53]首次利用魚藤酮誘導(dǎo)PD小鼠發(fā)現(xiàn)，多巴胺類AC在PD視網(wǎng)膜內(nèi)明顯減少。為了進一步研究AC在PD視網(wǎng)膜中的作用機制，Peoples等[54]用近紅外光分別刺激急性和慢性PD小鼠，結(jié)果顯示，近紅外光既能保護多巴胺類AC，還能挽救受損AC，提示光誘導(dǎo)多巴胺的分泌可能緩解PD引起的視網(wǎng)膜損傷。另一方面，臨床數(shù)據(jù)也顯示，PD患者的視網(wǎng)膜功能、色覺和對比敏感度下降[11,55]。因此，PD視網(wǎng)膜內(nèi)多巴胺的缺乏可能是PD患者視功能障礙的發(fā)病機制及重要特征。

3.2AC在青光眼中的研究 青光眼是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡和軸突變性為主要特征的一類不可逆性致盲性眼病。迄今為止，引起青光眼神經(jīng)節(jié)細胞變性的機制尚未明確。在動物實驗中，急性高眼壓不僅引起神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，視錐細胞[9]和膽堿能AC[56]也出現(xiàn)損傷。而在自身免疫性青光眼中，熱激蛋白27與S100B蛋白協(xié)同作用亦可導(dǎo)致膽堿類AC減少[57]。此外，Takahama等[58]發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長因子-AA可通過與星形膠質(zhì)細胞和GABAergic AC上的受體結(jié)合，間接介導(dǎo)神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用。因此，膽堿類AC和GABAergic AC可能間接參與青光眼的疾病發(fā)展，但還需進一步探討視網(wǎng)膜AC在青光眼發(fā)病機制中的作用。

3.3AC在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的研究 糖尿病視網(wǎng)膜病變是以視網(wǎng)膜微血管病變?yōu)橹饕卣鞯奶悄虿⊙鄄坎l(fā)癥，臨床上將其分非增殖型視網(wǎng)膜病變和增殖型視網(wǎng)膜病變。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元變性早于視網(wǎng)膜微血管病變，并提出了“神經(jīng)血管單元”學(xué)說[59]。在糖尿病動物模型中，除神經(jīng)肽生長抑素和皮質(zhì)抑素降低外[60]，膽堿類AC和GABAergic AC數(shù)量也明顯減少[10,61]。但暫未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜AC與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關(guān)系。

3.4AC在先天性眼科疾病中的研究 AC分泌的神經(jīng)遞質(zhì)不僅參與了視網(wǎng)膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可通過非對稱性抑制作用調(diào)控神經(jīng)節(jié)細胞對方向的選擇性。據(jù)報道，特發(fā)性先天性眼球震顫與X染色體FRMD7基因突變相關(guān)[62]。在動物實驗中，Yonehara等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RMD7基因一方面特異性表達于視網(wǎng)膜膽堿能AC中；另一方面，靶向失活FRMD7基因，小鼠出現(xiàn)眼球震顫并且水平方向上的視動反射消失，提示膽堿能AC可能在控制眼球運動和凝視等方面具有特殊作用。此外，Al-Hujaili等[63]對先天性靜止性夜盲患者進行隨訪發(fā)現(xiàn)，此類患者除夜間視力受損外，還出現(xiàn)軸性近視和眼球震顫。雖然先天性眼科疾病的發(fā)生機制尚不完全清楚，但眼軸增長和眼球震顫可能與視網(wǎng)膜多巴胺含量改變以及AC功能障礙有關(guān)。

4 小結(jié)和展望

AC作為視網(wǎng)膜最為豐富的抑制性中間神經(jīng)元，參與了視網(wǎng)膜的發(fā)育及生物電信號的形成，介導(dǎo)了視覺的成像和非成像功能，因此，AC的功能顯得尤為重要。在發(fā)育過程中，調(diào)控因子水平的變化均可導(dǎo)致AC發(fā)育異常，影響視網(wǎng)膜的功能；此外，不同類型AC又在諸多眼科疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前，需克服形態(tài)學(xué)和分子學(xué)分類的難題，利用靈敏且有效的新技術(shù)，結(jié)合AC形態(tài)、分類及分化特點，進一步研究各亞型AC的功能，以找到可以無創(chuàng)性檢測視網(wǎng)膜AC的有效方法。隨著AC功能的不斷確定，結(jié)合臨床相關(guān)檢查參數(shù)，將有助于了解眼科疾病的發(fā)生發(fā)展，甚至有望為視網(wǎng)膜疾病的治療提供新的思路及治療靶點。