氧化應激和炎癥反應中Nrf2/HO-1與MAPK的相關性

李彥霖，郁葉，郭婷莉，易鑫堯，張萌，陳莉娜

(西安交通大學 a.第一臨床醫(yī)學院， b.基礎醫(yī)學院，西安 710061)

核因子E2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是體內一種重要的轉錄調節(jié)因子，調節(jié)多種抗炎和抗氧化基因的表達，在機體的損傷應答反應中居核心地位；血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)-1是血紅素分解代謝過程中的限速酶，可降解血紅素為一氧化碳(carbon monoxide,CO)、膽綠素和鐵離子(Fe2+)，是Nrf2發(fā)揮抗炎和抗氧化作用的重要媒介[1-2]。Nrf2與HO-1構成的信號通路參與多種組織器官的炎癥相關病理過程。而促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是細胞外信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘炔康闹匾獋鬟f者，可被氧化應激及多種促炎因子激活，廣泛參與細胞內多種信號傳遞過程，對Nrf2/HO-1通路具有激活和表達調節(jié)的作用[3]。目前國內外已有大量關于Nrf2/HO-1與MAPK相互作用的研究，但由于細胞和組織類型的不同以及損傷和保護性藥物的不同而呈現(xiàn)多樣化的結果。盡管Nrf2/HO-1與MAPK信號通路存在相互作用，但不同的MAPK與Nrf2/HO-1之間、Nrf2的多種細胞內作用與MAPK之間以及一些其他分子在MAPK與Nrf2/HO-1信號通路間所起的作用目前尚不明確。現(xiàn)就氧化應激和炎癥反應中Nrf2/HO-1與MAPK的相關性予以綜述。

1 Nrf2/HO-1信號通路概述

1.1Nrf2的結構和功能 Nrf2是一種廣泛存在于各種組織細胞中的轉錄因子，具有氧化還原敏感性，可調控多種細胞保護性基因的應激誘導激活[4-5]。Nrf2主要有7個高度保守的環(huán)氧氯丙烷相關蛋白同源結構域(Nrf2 epichlorohydrin homology，Neh)：Neh1區(qū)與核內小肌腱膜的纖維肉瘤(small musculo aponeurotic fibrosarcoma，Maf-S)蛋白形成異二聚體，識別并結合抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)上的相關序列；Neh2區(qū)是Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)依賴的調節(jié)區(qū)，而Neh6區(qū)是非Keap1依賴的調節(jié)區(qū)；Neh3區(qū)是一個反式激活結構域；Neh4和Neh5區(qū)結合環(huán)腺苷酸反應元件結合蛋白參與Nrf2轉錄活性的調控；Neh7參與類視黃醇X受體α的結合[6]。Keap1是一種富含硫醇的蛋白質，錨定在細胞骨架的肌動蛋白上，被親電分子修飾后失活，生理狀態(tài)下，Keap1可促進Nrf2的泛素化和最終降解[4,6]。

1.2HO-1的結構和功能 在哺乳動物中，HO家族由兩種酶組成，即HO-1基因編碼的HO-1和HO-2基因編碼的HO-2[2]。HO基因家族可保護細胞免受多種應激刺激損傷(病原體、傷害、壓力和功能失調等)，是重要的細胞保護機制之一[7]。HO-1的表達受多種內源性和外源性因素誘導，包括血紅素、紫外線照射、細菌脂多糖、氧化應激、缺氧、多種促炎因子及人工誘導劑(如血晶素)等，主要功能是降解血紅素為CO、膽綠素和Fe2+[2,8]。血紅素具有潛在的促炎和促氧化作用，而CO等酶解產物普遍具有抗炎和抗氧化作用[9]。

除酶解作用外，HO-1還與細胞內多條信號通路相互影響，這些信號通路可上調或下調HO-1的表達水平，同時HO-1又通過這些信號通路發(fā)揮激活抗氧化基因表達及抑制促炎因子合成等細胞保護作用，而這種作用可能是獨立于其酶解反應活性[10-11]。以往研究表明，HO-1與其他多種分子形成的信號軸在肝、腎、動脈等多種器官的炎癥反應和纖維化進程中扮演重要角色，且這一作用離不開HO-1與巨噬細胞的密切聯(lián)系[12-14]。

1.3Nrf2對HO-1表達的調控及意義 HO-1是受Nrf2調節(jié)的最重要的基因之一，在細胞中發(fā)揮重要的抗炎、抗氧化調節(jié)作用。通常Nrf2與Keap1結合于胞質內并處于抑制狀態(tài)，ARE與Maf-S結合于核內處于失活狀態(tài)；在應激條件下，胞外氧化劑刺激使Nrf2磷酸化或Keap1-SH基團修飾而促進Nrf2與Keap1的解離；Nrf2與Keap1解離后，聚集在核內與Maf-S形成異二聚體，并與ARE結合，Nrf2/ARE導致核基因易位并誘導其下游抗氧化酶(HO-1等)高表達，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化作用[1,15-16]。在藥物研發(fā)中，Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用已成為一個重要的靶點，多種間接的親電性抑制劑(如姜黃素和蘿卜硫素)和直接的非共價抑制劑(如一些多肽抑制劑)通過Keap1-Nrf2蛋白質-蛋白質相互作用上調ARE控制的細胞保護性氧化應激反應酶的表達，從而發(fā)揮治療作用[17]。

動物實驗表明，Nrf2/HO-1級聯(lián)反應對肺、腎、肝、結腸、血管內皮等組織器官以及糖尿病、缺血再灌注損傷等病理生理過程中的氧化應激和炎癥反應均具有顯著的抑制效果，當Nrf2/HO-1表達上調時，活性氧類、促炎因子等顯著減少[18]。川芎嗪等藥物可通過增加Nrf2的核轉移、誘導HO-1在組織中的表達，抑制氧化應激和炎癥反應[19]。Amata等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1在氧化應激誘導的早產兒肺損傷反應中被激活，誘導一定數(shù)量的抗氧化、抗炎信號分子表達，從而發(fā)揮抗損傷作用，這可能較激活單個抗氧化基因更有效。然而，Nrf2/HO-1的抗炎、抗氧化作用并不總是對機體有利。有研究表明，Nrf2和HO-1過量表達可成為癌癥發(fā)生、發(fā)展的促進因素，Nrf2與HO-1作為胰腺癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤標志物的作用已受到關注[21]。Nrf2/HO-1在癌癥中發(fā)揮的作用可能與HO-1酶解產物的抗氧化、抗凋亡和免疫調節(jié)作用有關；同時，Nrf2/HO-1通路獨立于酶活性以外的核水平上的轉錄調節(jié)功能也起重要作用，該作用可能會抑制機體對癌細胞的控制和清除[21-22]。

2 MAPK概述

目前研究較多的MAPK有p38、胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)三個亞群。p38是一種應激激活的蛋白激酶，磷酸化p38是其活化狀態(tài)。目前已發(fā)現(xiàn)4種p38異構體，分別為p38α、p38β、p38γ和p38δ。p38α在機體內廣泛表達，其他p38亞型的表達具有組織特異性，通常p38特指p38α[23-24]。臨床及動物實驗表明，p38信號通路在炎癥和免疫反應中扮演重要角色，下調p38分子表達水平可有效抑制脂肪細胞肥大和炎癥反應的發(fā)展，并抑制組織纖維化進程，而p38抑制劑可產生相反的作用，但此作用仍存在一定的爭議[24-26]。ERK包含8種亞型，具有相同的活化模體蘇氨酸-谷氨酸-酪氨酸，ERK1/2是ERK八種亞型的原型，在MAPK/ERK1/2催化下，活化模體中的酪氨酸和蘇氨酸被磷酸化而激活，而活化的ERK可磷酸化核內多種信號通路的蛋白質[3,27]。JNK又被稱為應激活化蛋白激酶，JNK1和JNK2在全身廣泛表達，JNK3的表達具有組織特異性[3]。氧化反應、滲透壓力以及促炎細胞因子等均可促進JNK活化，活化的JNK介導的炎癥反應可以促進癌癥的發(fā)生[3,28]。

3 MAPK對Nrf2/HO-1信號通路的調節(jié)作用

3.1p38對Nrf2/HO-1通路的調節(jié)作用 p38促進Nrf2/HO-1激活和表達的可能機制為：p38磷酸化Nrf2，使其與胞質中的Keap1分離，從而促進Nrf2的活化[29-31]。此外，這一調節(jié)作用也可能與p38促進相關蛋白質的核轉移、保護Nrf2免受降解有關[32]。p38特異性抑制劑通過抑制p38磷酸化而阻止Keap1的降解和Nrf2的核易位以及隨后HO-1的誘導表達[29]。但也有研究表明，抑制p38不改變Nrf2的核豐度以及與DNA結合的能力，p38和Nrf/HO-1通路在氧化應激過程中可能是平行誘導激活[33]。Sun等[34]發(fā)現(xiàn)，抑制p38活化對Nrf2表達的影響不顯著，但對HO-1的誘導表達有劑量依賴性的抑制作用，故認為p38活化雖不是穩(wěn)定Nrf2所必需，但HO-1的誘導表達卻與其緊密關聯(lián)，即p38活化可能是Nrf2轉錄激活HO-1所必需的。這些不一致的結果可能與p38在細胞內扮演多種角色有關。已知超過100種蛋白激酶和轉錄因子等蛋白質可以直接被p38磷酸化，即一方面p38可以通過某些信號分子通路誘導抗炎、抗氧化因素的上調，另一方面又通過其他方式發(fā)揮促進炎癥反應和氧化應激的作用，不同的刺激因素和不同的組織細胞對p38和Nrf/HO-1通路平衡的影響不同[24]。同時還應注意，一些藥物在發(fā)揮抗炎特性時，表現(xiàn)出對p38活化的抑制以及對Nrf2核轉移和HO-1表達的促進，提示應激反應中其他通路對Nrf2/HO-1的調控也會影響最終效應，甚至在某些情況下較p38更為重要[35]。

3.2ERK和JNK對Nrf2/HO-1通路的調節(jié)作用 較高的ERK活性往往伴隨促炎基因、過氧化物酶體脂肪酸氧化以及損傷反應自噬通量標志物的表達增強，磷酸化的ERK是ERK的活化形式，下調磷酸化的ERK和Nrf2的表達水平可以預防氧化應激和炎癥反應相關疾病[36-38]。但也有研究表明，在氧化應激中，ERK水平顯著降低，而藥物在改善組織損傷時表現(xiàn)出促進ERK活化和Nrf2核轉移的作用，總Nrf2同時增加，HO-1的表現(xiàn)與Nrf2一致[32,36]。ERK抑制劑和Nrf2小干擾RNA可以顯著逆轉這一效應，從另一方面支持了以上結果[39]。ERK1/2抑制劑可顯著抑制槲皮素誘導的Nrf2和HO-1的表達，表明ERK1/2活化對于Nrf2的穩(wěn)定及HO-1轉錄的后續(xù)激活是必需的[34]。

在心肌細胞、輸卵管上皮細胞以及SH-SY5Y、BV-2等細胞系中JNK活化，可促進Nrf2磷酸化和核轉移以及HO-1表達，發(fā)揮抗炎、抗氧化及抗細胞凋亡作用，而JNK抑制劑可顯著抑制這一效應[32,40-42]。珊瑚木苷可通過促進Nrf2核轉移抑制JNK活性，Nrf2沉默可不完全逆轉雷公藤甲素誘導的磷酸化JNK表達增加，減弱珊瑚木苷對氧化應激的抑制，這與Nrf2調節(jié)抗氧化酶表達、抑制活性氧類產生有關[43]?？梢?，Nrf2與JNK之間具有復雜的相互作用，可能還有其他分子參與調節(jié)。目前關于ERK與JNK對Nrf2/HO-1信號通路調控的研究較少，具體機制仍不明確。

3.3p38、ERK、JNK三者對Nrf2/HO-1通路調節(jié)作用的比較 研究表明，p38、ERK1/2、JNK三者可協(xié)同激活Nrf2/HO-1通路，分別應用阻斷劑均可顯著抑制Nrf2核轉移并降低HO-1的表達水平，而Nrf2又可通過調節(jié)基因表達影響JNK活化(圖1)[32,34,41]。然而，在某些情況下，MAPK的作用可能不完全相同，甚至相反。Ahn等[44]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2核轉移增強時，p38、ERK和JNK的磷酸化均增強，但分別給予三者的抑制劑后，p38抑制劑對Nrf2的影響最小。仙鶴草內酯和去甲基仙鶴草內酯雖不改變p38、ERK、JNK的比例，但可促進ERK、JNK的磷酸化，抑制p38的磷酸化，并提高Nrf2/Keap1比值以及HO-1的表達[35]。在(+)-落葉松樹脂醇(lariciresinol，LRSL)抗氧化性能的研究中，將p38和ERK特異性抑制劑用于LRSL處理的細胞中，p38抑制劑組LRSL誘導的核Nrf2豐度和HO-1表達增加均受到抑制，而ERK抑制劑組的變化卻不明顯，提示可能只有p38參與了LRSL誘導的Nrf2/HO-1的激活[45]。此外，p38和JNK抑制劑均可顯著抑制砷誘導HO-1表達的效應，ERK抑制劑則無顯著效應[46]。這些結果提示，刺激因素和應答組織不同，可能對不同MAPK的活化具有不同作用，但具體機制有待進一步研究。在漢黃芩素抗軟骨細胞炎癥反應中，Nrf2/HO-1被激活，但p38、ERK、JNK均未發(fā)生變化，提示除MAPK外還有其他機制影響Nrf2和HO-1的表達[47]。MAPK對HO-1的影響很可能并非單方面的，而存在反饋作用或相互作用。血晶素是常用的HO-1誘導劑，鋅原卟啉-Ⅸ是HO-1的抑制劑。在內毒素誘導的肺巨噬細胞炎癥模型中，血晶素組p38 MAPK表達水平顯著升高，而HO-1抑制劑鋅原卟啉-Ⅸ組的結果相反；但也有研究得出不一致的結果，提示不同條件下HO-1對MAPK的影響也不盡相同[48-49]。目前血晶素和鋅原卟啉-Ⅸ對HO-1的作用機制尚不明確，有待進一步研究。

MAPK：促分裂原活化的蛋白激酶；Nrf2：核因子E2相關因子2；HO-1：血紅素加氧酶1

4 HO-1酶解產物CO與MAPK信號通路的相關性

HO-1降解血紅素的過程是體內CO的最主要來源。CO具有調節(jié)促炎和抗炎細胞因子表達的作用，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[50]。CO可促進白細胞介素(interleukin，IL)-10等抗炎因子釋放，抑制IL-6、IL-1β等促炎因子釋放，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1/CO組成機體重要的內源性保護系統(tǒng)，參與體內多種生理和病理過程，包括調節(jié)免疫系統(tǒng)功能、減少活性氧類的產生、減輕細胞膜脂質過氧化損傷等[50]。

CO釋放分子(carbon monoxide-releasing molecule，CORM)是一類可以穩(wěn)定釋放CO的化合物，不同的CORM對不同MAPK的影響不同。研究發(fā)現(xiàn)，CORM-2通過激活p38和ERK1/2分子，CORM-3通過激活JNK/激活蛋白-1通路，最終促進HO-1基因的表達[51-52]。CORM ALF-186可活化p38，抑制ERK1/2磷酸化，對JNK無顯著影響；此外，CORM也對Nrf2有一定的作用[53]。CORM A-1可提高肝中毒模型中Nrf2信使RNA和蛋白水平，并與Keap1的Kech域結合，最終促進Nrf2的核轉移和ARE相關基因的表達，同時體內產生的CO對自身Nrf2/HO-1通路可能有一定的正反饋作用[54]。但體內HO-1酶解作用所產生的CO是否具有相同的作用，仍需更為直接的證據支持。

5 小 結

氧化應激和炎癥反應參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，影響疾病預后，是許多疾病治療的關鍵。MAPK和Nrf2/HO-1信號通路在機體的調控網絡中占據關鍵位置，兩者的相互作用影響氧化應激和炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展。在氧化應激或其他損傷作用刺激下，機體產生IL等細胞因子，這些細胞因子可激活MAPK分子，促進Nrf2轉移，從而上調HO-1的表達，而HO-1降解血紅素的產物CO可能對多種MAPK具有調節(jié)作用。通過這一系列反應，機體內最終達到氧化和抗氧化、促炎和抗炎反應的平衡。但在不同刺激因素下和不同的組織細胞中，這些分子間的作用并不完全一致。雖然目前已有大量研究在探討不同刺激因素和細胞類型因素影響下這些關鍵分子的變化，但具體機制尚待進一步研究。