人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞及分化產(chǎn)物在發(fā)育毒性研究中的應(yīng)用

王正媚，裴軼勁

(廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 東莞 523808)

藥物的開發(fā)是一個(gè)非常復(fù)雜、昂貴和耗時(shí)的過程，由于安全性和有效性問題，絕大多數(shù)的藥物在臨床試驗(yàn)中失敗。發(fā)育毒性指外源物在個(gè)體發(fā)育為成體的過程中誘發(fā)的有害影響，主要表現(xiàn)在發(fā)育生物體死亡、生長改變、結(jié)構(gòu)異常及功能缺陷等方面，可采用發(fā)育毒性試驗(yàn)對發(fā)育過程中的生物體毒性進(jìn)行評(píng)估。傳統(tǒng)發(fā)育毒性評(píng)價(jià)體系在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，主要是評(píng)價(jià)藥物的三段生殖毒性試驗(yàn)[1]。但隨著動(dòng)物福利“替代、優(yōu)化、減少(3R)”原則的大力推廣[2]，體外發(fā)育毒性試驗(yàn)的評(píng)估逐漸成為研究關(guān)注的焦點(diǎn)。

1997年，歐洲替代方法驗(yàn)證中心驗(yàn)證了基于小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)建立的胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(embryonic stem cell test，EST)在體外評(píng)估藥物胚胎發(fā)育毒性的有效性[3]。EST是利用小鼠ESCs可以定向誘導(dǎo)分化的能力，模擬早期胚胎的發(fā)育進(jìn)程，進(jìn)而觀察藥物對胚胎發(fā)育的影響及可能機(jī)制。與體內(nèi)非臨床研究實(shí)驗(yàn)相比，EST具有不需要使用實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)。但因存在種屬差異的問題，藥物對小鼠ESCs的發(fā)育毒性不能完全反映人類的疾病病理及機(jī)制。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)來源于表達(dá)特殊多能基因的成熟已分化細(xì)胞，與ESCs非常相似，不僅包括細(xì)胞形態(tài)、生長特性、ESCs標(biāo)記基因表達(dá)等方面，還體現(xiàn)在DNA甲基化方式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)、形成嵌合體動(dòng)物等方面[4]。人iPSCs(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)成功避開了人ESCs面臨的倫理和法律問題，可代替人ESCs作為一種新的體外發(fā)育毒性評(píng)價(jià)模型?，F(xiàn)就hiPSCs發(fā)展的基本信息及其在心肌毒性、肝毒性和神經(jīng)毒性研究中的應(yīng)用予以綜述。

1 iPSCs概述

iPSCs通過轉(zhuǎn)錄因子基因的異位表達(dá)，使體細(xì)胞重編程形成類似ESCs的成熟細(xì)胞。2006年，Takahashi和Yamanaka[5]從24個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中篩選出OSKM——八聚體結(jié)合蛋白4(octamer-binding protein 4，Oct4)、SRY相關(guān)高遷移率族基因2(SRY-related high mobility group-box gene 2，Sox2)、Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4，Klf4)、骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc)，并通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將4個(gè)基因?qū)胄∈蟮钠つw成纖維細(xì)胞中，使該體細(xì)胞重編程獲得類胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞。隨后，應(yīng)用相同的方法，hiPSCs由成人皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生[6]。為了提高重編程效率以及避免畸變形成，研究人員使用了不同的轉(zhuǎn)錄因子組合如OSNL(Oct4、Sox2、Nanog、RNA結(jié)合蛋白Lin28)，OSML(Oct4、Sox2、c-Myc、RNA結(jié)合蛋白Lin28)，OSK(Oct4、Sox2、Klf4)等重組體細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄因子也從4個(gè)減至2個(gè)甚至1個(gè)(如O、OS)[7]。然而，轉(zhuǎn)錄因子的導(dǎo)入以病毒為載體，對于細(xì)胞后期的使用可能存在安全隱患。因此，研究者利用重組蛋白誘導(dǎo)技術(shù)或基于高含量化學(xué)熒光法篩選出的代替轉(zhuǎn)錄因子的小分子化合物成功誘導(dǎo)出iPSCs[8-10]，這些方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSCs不再依賴于基因?qū)?，更具有安全性?/p>

iPSCs是可再生的種子細(xì)胞，不僅能提供豐富的細(xì)胞來源，還可以分化成不同類型的成體細(xì)胞。目前，iPSCs已被證實(shí)可分化成心臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞、分泌胰島素的胰島成熟細(xì)胞和肝細(xì)胞等[11-16]。具有沿著特定譜系分化特性的iPSCs使細(xì)胞發(fā)育和特異性方面的毒性研究成為可能，對于心臟毒理學(xué)、肝毒理學(xué)以及神經(jīng)毒理學(xué)等研究，iPSCs在促進(jìn)藥物開發(fā)以及提高藥物安全性的體外系統(tǒng)方面提供了巨大的機(jī)會(huì)，因此在發(fā)育毒性替代模型的研究中日益受到關(guān)注。

2 hiPSCs在心臟發(fā)育毒性方面的應(yīng)用

因原代人心肌細(xì)胞的缺乏，hiPSCs來源的心肌細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells-cardiomyocytes，hiPSC-CM)被視為一種強(qiáng)有力的替代來源。針對hiPSCs向心肌細(xì)胞的分化，前期研究人員主要采用擬胚體形成法、內(nèi)胚層細(xì)胞共培養(yǎng)法以及生長因子誘導(dǎo)法獲得心肌細(xì)胞，但是這些方法存在低效性、異質(zhì)性高的問題。使用高特異性糖原合酶激酶-3抑制劑CHIR99021、Wnt應(yīng)答抑制劑IWR等小分子調(diào)節(jié)Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)，并結(jié)合流式細(xì)胞儀、免疫熒光技術(shù)篩選，使hiPSCs高效產(chǎn)生心肌細(xì)胞，且具有重復(fù)性[17-18]。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的成熟，研究人員通過優(yōu)化微流系統(tǒng)，采用循環(huán)搏動(dòng)血流動(dòng)力學(xué)來調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)hiPSC-CM的成熟，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，此系統(tǒng)培養(yǎng)的hiPSC-CM具有更強(qiáng)的收縮性[11]。Branco等[12]在小分子調(diào)節(jié)信號(hào)途徑基礎(chǔ)上建立了hiPSC-CM 三維平臺(tái)，結(jié)果表明，與二維平臺(tái)相比，三維心臟分化更能促進(jìn)hiPSC-CM結(jié)構(gòu)和功能上的成熟。

hiPSC-CM具有可重復(fù)性和大規(guī)模生產(chǎn)特點(diǎn)，有希望成為具有廣闊應(yīng)用前景的心臟發(fā)育毒性評(píng)價(jià)模型。與傳統(tǒng)EST相似，可通過檢測藥物對hiPSCs分化為心肌細(xì)胞的抑制程度以及對心肌細(xì)胞形態(tài)與活力的影響評(píng)價(jià)藥物發(fā)育毒性，還可不斷嘗試在細(xì)胞生理功能、心肌細(xì)胞標(biāo)志物等方面進(jìn)行評(píng)估。多樣化指標(biāo)的探索有助于提高h(yuǎn)iPSCs在心臟發(fā)育毒性評(píng)價(jià)應(yīng)用方面的準(zhǔn)確性及有效性。

2.1心肌功能 用iPSCs誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞評(píng)價(jià)藥物的心臟毒性逐漸受到關(guān)注。機(jī)體心肌細(xì)胞的主要功能為搏動(dòng)射血，體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在顯微鏡下可見跳動(dòng)。傳統(tǒng)EST通過對跳動(dòng)心肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)判別藥物對細(xì)胞分化的抑制程度，但是這種形態(tài)方法比較主觀，受到觀察者經(jīng)驗(yàn)的限制。測量hiPSC-CM鈣通量可以間接準(zhǔn)確地反映心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率，將體外高通量篩選模型與成像技術(shù)結(jié)合對已知體內(nèi)毒性藥物進(jìn)行心臟毒性評(píng)價(jià)，可以較精確地檢測藥物引起的心臟功能異常[19-21]。

心肌細(xì)胞是可興奮細(xì)胞，即能夠產(chǎn)生動(dòng)作電位，通過興奮-收縮偶聯(lián)使心肌細(xì)胞跳動(dòng)并發(fā)揮功能，動(dòng)作電位的產(chǎn)生涉及眾多通道的開閉，其中人類快速延遲性整流性鉀通道基因編碼的通道在心臟動(dòng)作電位復(fù)極中起至關(guān)重要作用，其特征為相對緩慢的激活以及異?？焖俸碗妷阂蕾囆缘氖Щ頪22]。人類快速延遲性整流性鉀通道是心臟毒性藥物的作用靶點(diǎn)，藥物作用后，出現(xiàn)人類快速延遲性整流性鉀通道阻斷、QT間期延長及尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速，表現(xiàn)為劑量和時(shí)間依賴性心律失常[23-24]。因此，檢測藥物對心肌細(xì)胞離子通道或動(dòng)作電位的影響也可反映藥物的發(fā)育毒性。

2.2心肌損傷標(biāo)志物 藥物作用于心肌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)心臟毒性的生物標(biāo)志物，如細(xì)胞代謝物、微RNA(microRNA，miRNA/miR)以及特定基因的表達(dá)。心肌細(xì)胞內(nèi)的代謝變化可用來評(píng)估藥物的心臟毒性，阿霉素暴露于hiPSC-CM后，心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的丙酮酸、乙酸、甲酸等代謝物可作為與阿霉素類似藥物誘發(fā)心臟毒性的代謝標(biāo)志[25]。另外，Palmer等[26]通過檢測經(jīng)多種藥物處理后的hiPSC-CM培養(yǎng)基的代謝成分，確定了代表不同代謝途徑的4種代謝物(花生四烯酸、乳酸、2′脫氧胞苷和胸苷)，其可作為評(píng)價(jià)多數(shù)藥物心臟毒性的標(biāo)志物。

miRNA在心臟病理診斷以及預(yù)防中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平及分布的改變與各種心血管疾病和心臟組織損傷有關(guān)。當(dāng)阿霉素或環(huán)孢素A等藥物暴露于心肌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)失調(diào)，如miR-182、miR-34、miR-1303及miR-377的表達(dá)上調(diào)，miR-1303、miR-4298的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致DNA損傷、氧化應(yīng)激與凋亡等心臟毒性的發(fā)生[27-29]，表明心肌細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)的miRNA可作為心臟毒性生物標(biāo)志物，用于篩選具有類似作用機(jī)制的心臟毒性藥物。

此外，對藥物誘發(fā)心臟毒性的基因組生物標(biāo)志物的鑒定，也可用于評(píng)價(jià)藥物心臟發(fā)育毒性。當(dāng)阿霉素和相關(guān)蒽環(huán)類藥物作用hiPSC-CM后，蛋白質(zhì)和信使RNA水平上的心肌細(xì)胞死亡受體的表達(dá)顯著上調(diào)以及維持離子穩(wěn)態(tài)和線粒體相關(guān)功能(如氧化代謝、ATP合成)特征基因的表達(dá)下調(diào)[30-32]，表明鑒定出的基因組可以預(yù)測與蒽環(huán)類作用機(jī)制相似藥物的心臟毒性。因此，各種心臟毒性生物標(biāo)志物的識(shí)別將有利于藥物心臟發(fā)育毒性的大規(guī)模篩選。

目前藥物安全篩選方法可確定一些心臟毒性候選藥物，但不能準(zhǔn)確反映人類心臟的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄學(xué)以及患者特定心臟毒性等[33]。hiPSC-CM作為一種功能強(qiáng)大且不斷發(fā)展的技術(shù)，能夠再現(xiàn)人類心肌細(xì)胞的許多特性及其藥物反應(yīng)，因此進(jìn)一步深入研究心肌功能參數(shù)及心肌標(biāo)志物能有效提高h(yuǎn)iPSCs在心臟發(fā)育毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

3 hiPSCs在肝臟發(fā)育毒性方面的應(yīng)用

人類原代肝細(xì)胞是臨床前毒理學(xué)篩選的金標(biāo)準(zhǔn)，但這類細(xì)胞的表型不穩(wěn)定且生物特性可變，以致使用受限[34]，因此，亟須發(fā)現(xiàn)表型穩(wěn)定且具有肝細(xì)胞特性的無限細(xì)胞系。hiPSCs來源肝細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells-hepatocytes，hiHEP)呈現(xiàn)出類似肝組織的表型，具有一致且無限的可用性，并且可建立不同個(gè)體基因型特異細(xì)胞[35]。hiPSCs誘導(dǎo)分化為hiHEP的過程主要包括內(nèi)胚層誘導(dǎo)、成肝細(xì)胞形成和肝細(xì)胞成熟階段，以此發(fā)育進(jìn)程為基礎(chǔ)的各種誘導(dǎo)分化方案隨之出現(xiàn)，主要有擬胚體形成法、外源性生長因子或小分子物質(zhì)的添加、轉(zhuǎn)基因方式的誘導(dǎo)、共培養(yǎng)方式的誘導(dǎo)。為了避免不完全細(xì)胞成熟和肝表型分化后的損失，人們探索了不同的策略來優(yōu)化分化方案。最新研究表明，改變小分子miRNA的表達(dá)水平以及減輕細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可促進(jìn)hiPSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的分化、增加肝標(biāo)志物表達(dá)以及維持肝臟本身的特性[36-37]。此外，以模擬體內(nèi)肝臟發(fā)生環(huán)境的三維hiHEP/內(nèi)皮細(xì)胞聚集體更能促進(jìn)hiHEP成熟，且hiHEP的尿素產(chǎn)生、糖原合成以及細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)的代謝活性也明顯高于在二維培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的hiHEP[13]。由hiPSCs分化的hiHEP所具有的特性使其成為一種有價(jià)值的體外肝臟毒性評(píng)估模型的細(xì)胞來源。除肝細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞平均面積和整合面積、細(xì)胞骨架完整性等基本形態(tài)特征外[35,38]，還可根據(jù)以下檢測指標(biāo)評(píng)估hiHEP體外藥物發(fā)育毒性。

3.1肝臟損傷標(biāo)志物 miRNA參與基因表達(dá)的調(diào)控，其表達(dá)在幾乎所有急性和慢性肝病中均有特異性的改變，可作為體外藥物所致肝毒性的橋接生物標(biāo)志物。利用肝毒性藥物對miRNA在肝細(xì)胞毒性方面的應(yīng)用及敏感性的研究表明，細(xì)胞中的miRNA可作為藥物誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性的特異性標(biāo)志物[39-40]。此外，miRNA在藥物誘導(dǎo)的肝毒性中也起著重要的調(diào)控作用。微囊藻毒素LR是導(dǎo)致原發(fā)性肝癌高發(fā)的危險(xiǎn)因素之一，可改變肝細(xì)胞中的miRNA表達(dá)譜，使miRNA在微囊藻毒素LR誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性中起重要的負(fù)調(diào)控作用，且miRNA的表達(dá)變化可改變S期肝細(xì)胞周期群體數(shù)量，從而影響肝細(xì)胞的增殖[41-42]。與目前用于肝臟損傷的生物標(biāo)志物相比，miRNA的敏感性和特異性更好，miRNA作為識(shí)別、預(yù)防及治療肝臟疾病的靶點(diǎn)，為體外藥物肝發(fā)育毒性的檢測提供更廣闊的機(jī)會(huì)。

CYP450是肝臟和其他組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中最重要的誘導(dǎo)酶。藥物通過細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)許多內(nèi)源性功能和信號(hào)通路的核受體誘導(dǎo)CYP450，從而被CYP450轉(zhuǎn)化為高活性代謝物，影響代謝途徑的毒性動(dòng)力學(xué)，造成一系列基本的細(xì)胞功能失調(diào)，如活性氧類過度產(chǎn)生、呼吸鏈功能障礙、細(xì)胞應(yīng)激、谷胱甘肽耗竭等。過量活性氧類和活性代謝物的產(chǎn)生可能因CYP450的過表達(dá)導(dǎo)致肝毒性，因此，CYP450可能是接觸外源物的生物標(biāo)志物，其誘導(dǎo)表達(dá)可能是肝臟毒性產(chǎn)生的第一個(gè)警報(bào)[43-44]。如CYP3A4介導(dǎo)的生物活化已被證實(shí)是呋喃類化合物防己苦素誘導(dǎo)肝毒性的潛在機(jī)制[45]。因此，肝臟損傷標(biāo)志物的識(shí)別將促進(jìn)藥物大規(guī)模篩選，利于藥物肝臟發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)。

3.2氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激反應(yīng)是藥物造成肝臟發(fā)育毒性的重要機(jī)制之一。細(xì)胞防御氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)是各種疾病，特別是氧化應(yīng)激引起的疾病中所必需的。當(dāng)藥物暴露于細(xì)胞時(shí)，Nrf2從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游靶基因，誘導(dǎo)各種基因表達(dá)水平的改變，可反映hiHEP氧化應(yīng)激的水平[46-47]。同時(shí)，藥物作用hiHEP產(chǎn)生的代謝物會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的耗竭以及活性氧類的積累，引起氧化應(yīng)激水平的增高。Wang等[48]基于人肝細(xì)胞驗(yàn)證了可通過提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和過氧化氫酶活性以及增強(qiáng)細(xì)胞核中Nrf2的表達(dá)來減輕藥物誘導(dǎo)的肝毒性。因此，在hiPSCs向肝臟分化過程中，可通過檢測反映氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)(如谷胱甘肽和活性氧類含量以及特定基因表達(dá))來評(píng)估藥物肝臟毒性。

3.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是合成甾醇和磷脂的主要場所，存在許多參與脂質(zhì)代謝的酶和調(diào)節(jié)蛋白。脂質(zhì)積聚是肝臟脂肪變性的標(biāo)志，主要受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的調(diào)控。當(dāng)高水平飽和脂肪酸和錯(cuò)誤折疊蛋白改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路觸發(fā)，脂質(zhì)代謝中基因的表達(dá)改變，從而誘導(dǎo)肝臟脂肪變性[49]。棕櫚酸通過介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)造成肝細(xì)胞活力的損害并干擾了細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝，引起肝細(xì)胞凋亡，而油酸則是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂毒性[50]。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能作為極低密度脂蛋白受體表達(dá)的驅(qū)動(dòng)因素，促使極低密度脂蛋白的分泌，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)肝臟脂質(zhì)的累積。Parafati等[51]在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)下，以不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸處理hiHEP，表明在沒有細(xì)胞凋亡的情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使hiHEP細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累增加了5倍。肝脂肪變性是可逆的代謝失調(diào)狀態(tài)，它的發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)存在緊密的聯(lián)系，通過檢測細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)水平可反映藥物對肝細(xì)胞的脂毒性。

總之，雖然hiHEP并不等同于原代肝細(xì)胞，但它們獲得了足夠程度的肝表型，可用于肝毒性研究，并且為探討遺傳性肝病的發(fā)病機(jī)制以及預(yù)測患者對藥物的特定治療或毒性反應(yīng)提供了新見解。

4 hiPSCs在神經(jīng)發(fā)育毒性方面的應(yīng)用

hiPSCs的使用為人類神經(jīng)細(xì)胞提供了穩(wěn)定和可再生的來源。迄今為止，hiPSCs已經(jīng)分化出各種類型的神經(jīng)細(xì)胞，包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等。在定向分化中，hiPSCs向神經(jīng)功能細(xì)胞的分化大致均經(jīng)過了神經(jīng)祖細(xì)胞這一階段，向此階段分化的方法主要有擬胚體形成法、貼壁培養(yǎng)法[52-53]。隨著分化技術(shù)的不斷提高，可通過優(yōu)化氧氣張力、pH和細(xì)胞密度等微環(huán)境調(diào)節(jié)劑，使hiPSCs更有效地進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞分化，且誘導(dǎo)分化方案逐漸從二維轉(zhuǎn)移到三維，三維神經(jīng)誘導(dǎo)模型不僅增加了神經(jīng)細(xì)胞的產(chǎn)量，形成具有較長神經(jīng)突的神經(jīng)元，并能夠概括神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)的相互作用[15-16]。

hiPSCs來源的神經(jīng)細(xì)胞可以為昂貴、耗時(shí)、有倫理爭議的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外原代培養(yǎng)提供一種替代方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。神經(jīng)細(xì)胞的活力和形態(tài)變化的可評(píng)估性是藥物神經(jīng)發(fā)育毒性評(píng)價(jià)的活躍研究領(lǐng)域，可通過檢測神經(jīng)突出生長及分支情況、細(xì)胞數(shù)量與活性、線粒體密度等指標(biāo)來研究受試物的神經(jīng)毒性[54-56]。此外，還可根據(jù)以下檢測指標(biāo)評(píng)估體外神經(jīng)發(fā)育毒性。

4.1神經(jīng)元功能 鉀通道是控制多數(shù)神經(jīng)元興奮性的基礎(chǔ)，負(fù)責(zé)設(shè)置靜息電位、降低興奮性、控制動(dòng)作電位的持續(xù)時(shí)間、形狀和發(fā)射頻率等。其中，電壓依賴性鉀通道Kv7/M廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)[57]，其穩(wěn)定的M電流可以抑制神經(jīng)元的持續(xù)性興奮，在神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，是開發(fā)神經(jīng)元、心血管和代謝疾病新藥物的重要藥理靶點(diǎn)。乙酰膽堿激動(dòng)M型膽堿受體(M受體)的激活對M電流有強(qiáng)烈的抑制作用，從而導(dǎo)致興奮性增加，降低動(dòng)作電位閾值，增加去極化和去極化軸突靜息電位[58-59]。hiPSCs源性神經(jīng)元是一種有用的基于人類細(xì)胞的分析方法，可用于體外檢測，通過激活M受體或抑制Kv7/M通道影響神經(jīng)元興奮性和誘發(fā)癲癇發(fā)作[60-61]。

4.2氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激是由多種外源物誘導(dǎo)并在毒性早期階段確定的細(xì)胞非特異性反應(yīng)，是引起神經(jīng)發(fā)育毒性的重要機(jī)制之一。藥物暴露于hiPSCs分化形成的神經(jīng)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出高水平的活性氧類和線粒體功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡或神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)的損傷[62-64]。Nrf2信號(hào)通路在細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制的調(diào)控中起核心作用，其通路的激活是氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志。檢測Nrf2信號(hào)通路在hiPSCs來源神經(jīng)細(xì)胞模型中的表達(dá)，可為通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激起作用的潛在神經(jīng)毒性化合物體外篩選和檢測提供依據(jù)[65-66]。因此，可通過檢測hiPSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中的氧化應(yīng)激水平指標(biāo)(如谷胱甘肽和活性氧類含量以及特定基因)的表達(dá)評(píng)估藥物神經(jīng)發(fā)育毒性。

4.3miRNA miRNA是關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)控器，miRNA譜較全基因組譜具有更強(qiáng)的細(xì)胞事件預(yù)測能力。miRNA在大腦中高度富集，通過調(diào)節(jié)發(fā)育時(shí)間、神經(jīng)干細(xì)胞分化和增殖、突觸形成和腦形態(tài)發(fā)生，在腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用[67-68]。miRNA的異常表達(dá)已被證明與多種藥物(麻醉劑、丙戊酸鈉、錳等)誘導(dǎo)的發(fā)育神經(jīng)毒性疾病有關(guān)，表明基于miRNA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是預(yù)期藥物神經(jīng)毒性的新靶點(diǎn)[69-72]。Zhang等[71]發(fā)現(xiàn)，長期暴露于麻醉藥物的發(fā)育中大腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的miR-132表達(dá)水平顯著上調(diào)，布比卡因與胰島素樣生長因子-1受體進(jìn)一步結(jié)合可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)毒性，表明miRNA在調(diào)節(jié)藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中起重要作用，是治療藥物神經(jīng)毒性的一個(gè)有前途的分子靶點(diǎn)。

雖然hiPSCs衍生的神經(jīng)發(fā)育毒性模型還不能完全模擬復(fù)雜的大腦系統(tǒng)，但通過對神經(jīng)功能及標(biāo)志物等多方面的評(píng)估，hiPSCs衍生的神經(jīng)細(xì)胞可為體外藥物發(fā)育毒性的高通量篩選提供新模型。

5 小 結(jié)

hiPSCs獲得方法相對簡單、穩(wěn)定，在技術(shù)和倫理方面具有明顯優(yōu)勢，目前已被廣泛應(yīng)用于多種研究，包括疾病模型、再生醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)和藥物毒性等。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的胚胎毒性研究實(shí)驗(yàn)主要用于檢測外源化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞毒性及胚胎發(fā)育毒性。iPSCs的產(chǎn)生為針對性疾病的研究以及新療法藥物的開發(fā)篩選提供了可能，可代替ESCs建立體外模型來評(píng)價(jià)受試物的發(fā)育毒性。然而，iPSCs是否與ESCs具有相同的分化潛力仍存在爭議；且由于條件和技術(shù)尚不完全成熟，iPSCs在體外的分化機(jī)制不能等同體內(nèi)的胚胎細(xì)胞發(fā)育，體外的培養(yǎng)條件也難以完全模擬體內(nèi)胚胎的生長環(huán)境[73]。此外，從體細(xì)胞衍生的iPSCs可能已經(jīng)被老化、化學(xué)或環(huán)境預(yù)暴露所改變，這種表觀啟動(dòng)表型能否在重編程后逆轉(zhuǎn)仍有待證明。

總之，以hiPSCs為基礎(chǔ)的高含量篩選方法在藥物發(fā)育毒性評(píng)價(jià)方面已獲得越來越多的關(guān)注。iPSCs的應(yīng)用在技術(shù)方面還存在諸多不足，但隨著研究的不斷深入，更多的檢測指標(biāo)將被發(fā)現(xiàn)，且可與流式細(xì)胞技術(shù)、細(xì)胞集落分析、實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)、熒光顯微分析等靈敏檢測技術(shù)相結(jié)合。iPSCs作為理想的種子細(xì)胞，相信未來會(huì)在體外藥物發(fā)育毒性評(píng)價(jià)方面發(fā)揮重要作用。