炎可寧片含量測定方法的研究進(jìn)展

李亞，熊英，黃鵬，普俊學(xué)

炎可寧片為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》收載品種，為常用中成藥之一，由黃柏、大黃、黃芩、板藍(lán)根、黃連5 味中藥制成，具有清熱瀉火、消炎止痢的功效，臨床用于急性扁桃腺炎、細(xì)菌性肺炎、急性結(jié)膜炎、中耳炎、癤癰瘰癘、急性乳腺炎、腸炎、細(xì)菌性痢疾及急性尿道感染的治療。有關(guān)炎可寧片成分研究的文獻(xiàn)較多，主要為對(duì)處方中各藥味單一或多個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定的方法研究，為了使炎可寧片的質(zhì)量得到進(jìn)一步的控制，本文簡要綜述了炎可寧片含量測定方法的研究進(jìn)展，以期為炎可寧片的質(zhì)量控制提供一定幫助。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是一種高效、高靈敏度、易回收的分析分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于中藥以及中藥制劑中多成分、微量成分的含量測定。本文中關(guān)于炎可寧片含量測定主要涉及的是分配色譜中的液-固色譜，通過配制一定濃度的對(duì)照品和供試品溶液，在平行條件下，測得供試品和對(duì)照品溶液的響應(yīng)信號(hào)（吸收峰面積），采用外標(biāo)法得出待測物的含量。

1.1 鹽酸小檗堿 鹽酸小檗堿又稱黃連素，是一種異喹啉生物堿，主要來源于黃柏、黃連、三顆針，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血壓等藥理作用［1］?，F(xiàn)代藥理研究表示，該成分可抑制生物膜的形成，起到廣譜抗菌作用，同時(shí)抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，減少炎性反應(yīng)［2-3］。

制劑生產(chǎn)中，黃柏以水煎提取后醇沉成稠膏入藥，受初膏濃度、溫度、醇料比等條件［4-5］的影響，鹽酸小檗堿易損失。因此鹽酸小檗堿除了能影響炎可寧片的藥效外，還能反映制劑工藝的提取、純化情況，是炎可寧片的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

鹽酸小檗堿多以游離態(tài)存在，為增大其提取率，一般用鹽酸與甲醇的配比溶液對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取。張飛［6］在研究炎可寧片中鹽酸小檗堿的提取時(shí)，分別采用配比為500 ∶1和100：1 的甲醇-鹽酸溶液對(duì)炎可寧片中的鹽酸小檗堿進(jìn)行提取，前者的提取效率優(yōu)于后者。

周靜安［7］建立了反相離子對(duì)色譜法測定鹽酸小檗堿的含量，以庚烷磺酸鈉作為反離子對(duì)，Shim-pack VP-ODS（200 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，得出鹽酸小檗堿的線性范圍為16.0～128.0 μg/ml。該方法獲得的鹽酸小檗堿含量真實(shí)，但不能完全反映主藥黃柏的質(zhì)量。

田軍等［8］對(duì)研細(xì)后的炎可寧樣品以稀乙醇為溶液進(jìn)行超聲提取，色譜柱為 C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相0.05 mol/L 磷酸二氫鈉（使用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3）：乙腈（70 ∶30），檢測波長為210 nm。結(jié)果顯示，對(duì)照品與供試品的峰皆在19.1 min 出現(xiàn)，且陰性對(duì)照顯示無干擾，專屬性強(qiáng)。

陳進(jìn)等［9］和袁夢(mèng)哲等［10］將樣品除去包衣后用鹽酸-甲醇（1 ∶100）溶液超聲處理，并經(jīng)中性氧化鋁柱洗脫分離，兩者皆使用C18 作為固定相，乙腈與磷酸二氫鉀的配比溶液作為流動(dòng)相。為較大程度地除去干擾，可考慮在之后的鹽酸小檗堿研究中使用堿性氧化鋁進(jìn)行樣品的前處理［11］。

宋冬梅等［12］和姜范成等［13］皆使用乙腈-0.1%磷酸溶液（50 ∶50）為流動(dòng)相；前者采用Inertsil ODS-3，檢測波長為345 nm。后者采用Welch Plus-C18 作為色譜柱，測定波長為265 nm。兩者在流動(dòng)相中加入了十二烷基磺酸鈉，其陰離子形式可與被測組分離子結(jié)合，可提高分離度，優(yōu)化分析效果。實(shí)際所得鹽酸小檗堿含量與根據(jù)藥典進(jìn)行分析所得理論含量不同，僅為其一半，推測可能原因之一是黃柏在經(jīng)水提醇沉的過程中丟失了部分鹽酸小檗堿，二是當(dāng)時(shí)2015 版藥典僅對(duì)味連有限度要求，因此黃連來源會(huì)影響鹽酸小檗堿含量?，F(xiàn)2020 版藥典補(bǔ)充了雅連、云連的限度要求，由此可減少品種變換所造成的含量差異。

1.2 黃芩苷 黃芩苷是黃酮類化合物，具有抗菌、抗氧化、抗病毒和抗癌等藥理作用［14-15］。其通過直接作用于免疫細(xì)胞，抑制炎癥細(xì)胞因子，起到抗炎作用［16］，但其在體內(nèi)的生物利用度偏低［17］，為炎可寧片的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

周靜安［18］通過設(shè)置不同的提取時(shí)間、柱溫、流動(dòng)相中乙腈與磷酸的配比進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)20 min 的提取時(shí)間、30 ℃的柱溫、乙腈與0.01%磷酸溶液22 ∶78 的配比，是最佳的測定條件，為之后的黃芩苷測定提供參考。

李鐵純等［19］和伊文敏［20］以Kromasil C18 作為色譜柱，前者以甲醇-水-磷酸（60 ∶40 ∶0.2）為流動(dòng)相，在280 nm 檢測波長處測定黃芩苷的含量；后者在316 nm 檢測波長、甲醇-冰醋酸-水（50 ∶1 ∶50）作為流動(dòng)相的條件下進(jìn)行測定。黃芩苷的測量應(yīng)加入陰性對(duì)照，驗(yàn)證其結(jié)果的真實(shí)性。

高長青等［21］以O(shè)DS 柱分離黃芩苷，以甲醇-水-醋酸（40 ∶60 ∶1）為流動(dòng)相進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，黃芩苷在8 min 出峰，且與其他成分峰無重合，黃芩苷在0.25～2.50 μg 時(shí)與峰面積呈線性關(guān)系，最低檢測限為3.7 μg/ml。經(jīng)驗(yàn)證回收率約為99%，所得含量真實(shí)。

張軍榮等［22］和鄢長余等［23］以70%乙醇作為溶劑并加熱回流30 min 得供試品溶液。兩者皆在280 nm 波長下采用外標(biāo)法分別在Dikma C18、甲醇-水-磷酸（47 ∶53 ∶0.2）和Welch Plus-C18、流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸水溶液（47 ∶53）的色譜條件下對(duì)黃芩苷進(jìn)行測量。結(jié)果顯示，通過以上方法測定黃芩苷含量的專屬性強(qiáng)，結(jié)果真實(shí)，重復(fù)性好。

1.3 大黃蒽醌類化合物 大黃蒽醌類化合物是大黃的有效成分，多以二蒽醌與苷結(jié)合的形式存在，包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等藥理作用［24］。在大黃蒽醌的提取工藝研究中，一般采用乙醇或甲醇回流提取、稀酸水解，最后三氯甲烷萃取三步驟。該提取方法用于樣品前處理能提高柱效和分離效果。

1.3.1 大黃總蒽醌 尹永芹等［25］在色譜柱 Kromasil C18、流動(dòng)相甲醇-0.1%的磷酸水溶液、檢測波長254 nm 的色譜條件下采用梯度洗脫的方法對(duì)大黃中5種蒽醌成分進(jìn)行同時(shí)定量，能較全面地反映大黃的質(zhì)量、提取純化情況。該作者通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定總蒽醌含量，顯示大黃素和大黃酚所占含量比例較高，易檢測，可作為大黃制劑的特征組分。

1.3.2 大黃酚 于遠(yuǎn)洋等［26］在色譜柱Welch Plus-C18、流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶15）、測定波長254 nm 的色譜條件下對(duì)樣品進(jìn)行測定，色譜圖顯示大黃酚的保留時(shí)間約為6 min，峰形對(duì)稱，與其他成分無重合，且缺大黃的陰性樣品顯示無干擾。該方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，適于炎可寧片中大黃酚的測定。

1.3.3 大黃素和大黃酚 劉譯［27］對(duì)同一廠家10 個(gè)批次的炎可寧片成分進(jìn)行測定。設(shè)置色譜條件為：色譜柱Dikma C18；流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸（80 ∶20 ∶1）；檢測波長254 nm，在該色譜條件下，目標(biāo)物與其他組分峰分離度皆大于1.5，同時(shí)該10 批次測得含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）皆小于6%，回收率為98%，結(jié)果真實(shí)可信。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可得大黃素和大黃酚的含量限度，不低于0.08 mg/片（0.3 g 劑量）。

張大軍等［28］對(duì)供試品的制備方法進(jìn)行考察，以成分含量作為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)采用三氯甲烷作為提取溶劑，加熱提取，萃取三次以上可使目標(biāo)物提取完全。在色譜柱Shim-pack C18、流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸（85 ∶15）、檢測波長254 nm 的色譜條件下對(duì)樣品進(jìn)行測定，所得圖譜特征峰明顯，分離度較好。測定結(jié)果顯示每片含大黃素和大黃酚總量均不少于0.4 mg。

林遠(yuǎn)鳳等［29］以Shimadzu C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，254 nm 為檢測波長，對(duì)不同組分和配比的流動(dòng)相進(jìn)行考察，最后確定甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶15）為流動(dòng)相。在該條件下所得成分峰形對(duì)稱，分離度好。且經(jīng)方法學(xué)考察，大黃素0.586～29.300 μg/ml，大黃酚線性范圍為1.581～79.050 μg/ml，兩者回收率均接近100%。

汪秀月［30］采用天津蘭博C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）作為色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1% 磷酸溶液（85 ∶15），并對(duì)大黃素和大黃酚進(jìn)行測量。磷酸的加入抑制了酚羥基的水解，減少了色譜峰的拖尾。結(jié)果顯示在該色譜條件下，樣品濃度和峰面積有相關(guān)性，線性范圍寬，大黃素為106.5～535.5 μg/ml，大黃酚為0.207～1.035 mg/ml。

1.3.4 大黃素和大黃酸 有研究采用Venus1lxbp-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈-0.2%磷酸溶液（65 ∶35）為流動(dòng)相對(duì)提取液進(jìn)行梯度洗脫，增加了待測成分在柱上的保留時(shí)間［31］。大黃酸約在3 min 處出峰，大黃素約在6 min 出峰，兩者與其他成分峰分離度均大于1.5%，經(jīng)方法學(xué)考察，該法適用于大黃素和大黃酸的測定，但其與其他方法一樣忽略了大黃中其他重要成分的測定，不利于對(duì)大黃藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.4 板藍(lán)根成分 板藍(lán)根為菘藍(lán)的干燥根，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗腫瘤等藥理作用［32-33］，其成分主要為核苷、有機(jī)酸、生物堿等9 類物質(zhì)，由于板藍(lán)根制劑的水煎煮工藝致使其有效成分破壞較大［34］，含量太低，儀器不足以檢測。一般采用含量較大、專屬性強(qiáng)的核苷作為板藍(lán)根制劑的測定項(xiàng)［35-38］。

1.5 綜合類 有效控制炎可寧片的質(zhì)量，多采用高效液相色譜法通過改變色譜條件同時(shí)對(duì)多種成分進(jìn)行測定，從色譜柱的型號(hào)、流動(dòng)相的組成與比例、檢測波長λ、待測成分四個(gè)方面歸納如表1［39-43］，除表1 報(bào)道的文獻(xiàn)外，許學(xué)麗等［44］對(duì)三個(gè)批次炎可寧片中的鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)行含量測定，色譜柱為InertSustain C18，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液，檢測波長為254 nm，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿與黃芩苷的含量最高，但不同批次含量差異較大，如鹽酸小檗堿，三批次含量RSD 大于1（精密性驗(yàn)證良好，排除分析誤差），推測可能是樣品原料質(zhì)量不均一引起的含量差異。

表1 炎可寧片中各待測成分HPLC 測定方法比較

2 其他方法

2.1 區(qū)帶毛細(xì)電泳法 區(qū)帶毛細(xì)電泳法［45］在中藥分析中分析廣泛，可在色譜的基礎(chǔ)上，通過電泳對(duì)物質(zhì)進(jìn)一步分離分析。生物堿在緩沖體系內(nèi)大多帶有正電荷，一般采用區(qū)帶毛細(xì)電泳法在一定pH 值下，加入有機(jī)修飾劑，通過毛細(xì)管對(duì)樣品進(jìn)行分離，根據(jù)電泳譜圖對(duì)樣品進(jìn)行分析。該方法操作簡便，分析高效、高速，廣泛應(yīng)用于藥品的分離分析檢測。

霍鵬等［46］建立了同時(shí)用外標(biāo)法測定炎可寧片中小檗堿、巴馬汀、藥根堿、大黃素、大黃酸含量的區(qū)帶毛細(xì)管電泳法。用甲醇超聲提取樣品兩次后合并提取液得到供試品，并對(duì)電泳條件進(jìn)行考察，在未涂層彈性石英毛細(xì)管中，確定90 mmol/L Tris-10 mmol/LCit（含30%乙腈，pH=8）的緩沖體系、25 kV 的分離電壓、8 s 的進(jìn)樣時(shí)間為較佳測定條件。該方法分辨率高，便于分離帶電離子，但巴馬汀和小檗堿由于結(jié)構(gòu)相似，難以達(dá)到基線分離。

2.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）法 液相色譜（LC）儀器與各種MS 儀器相結(jié)合［47-48］，不僅可以提供藥物的含量與結(jié)構(gòu)信息，也不要求成分完全分離，且不需要揮發(fā)或衍生化，靈敏高效且易操作，具有高效的分離分析能力，還能提供化合物的質(zhì)量信息，在藥學(xué)領(lǐng)域被廣泛使用。張丹等［49］對(duì)炎可寧片中五種藥味的指標(biāo)成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素的含量進(jìn)行同時(shí)測定。色譜條件：色譜柱 ACQUITY UPLC BEN C18，流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正負(fù)離子切換模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）去除干擾信號(hào)。該測定方法采用色譜和質(zhì)譜兩種儀器共用分析，通過設(shè)置混合對(duì)照和陰性對(duì)照，準(zhǔn)確并高效對(duì)炎可寧片的各成分進(jìn)行測定。

3 結(jié)語

經(jīng)方法學(xué)研究考察，各測定方法的線性、重現(xiàn)性以及回收率等均較好，對(duì)于炎可寧片的含量測定皆具有可行性。對(duì)于炎可寧片成分的含量測定，多采用高效液相色譜法，該方法因靈敏度高、專屬性強(qiáng)、檢測限低，更適用于炎可寧片的質(zhì)量控制與分析。

炎可寧片是由多種藥味組成的中藥復(fù)方，方中的各味藥都是不可取代的，單一成分并不能如實(shí)反映其產(chǎn)品的質(zhì)量，因此建議結(jié)合處方方解，以多成分作為炎可寧片質(zhì)量的評(píng)估指標(biāo)，以便全面科學(xué)地控制藥品質(zhì)量。