高效液相色譜法及超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在多種腎上腺皮質(zhì)激素檢測中的應(yīng)用價值

吳凡，劉繼華，陳祖芬

腎上腺皮質(zhì)激素具有抗炎、抗過敏、抗休克及免疫抑制等多種藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛。炎癥細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞等，激素可通過抑制其吞噬作用、溶酶體酶的釋放及炎癥因子的合成、釋放而減輕和防止組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。皮質(zhì)激素能對抗細(xì)菌內(nèi)毒素對機(jī)體的刺激反應(yīng)，減少細(xì)胞損傷，發(fā)揮抗毒、抗休克作用；此外，皮質(zhì)激素還可防止或抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及延遲性的過敏反應(yīng)，降低免疫球蛋白與細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，并抑制白介素的合成與釋放，減輕原發(fā)免疫反應(yīng)的擴(kuò)展，從而起到免疫抑制作用。因此，部分藥品為了增強(qiáng)藥效，組分中添加一定量的腎上腺皮質(zhì)激素，從而增強(qiáng)抗炎效果。其他行業(yè)如食品中常需檢測激素殘留量及腎上腺皮質(zhì)激素［1-3］。本研究旨在探討HPLC-PDA 法及UPLC-MS/MS 檢測腎上腺皮質(zhì)激素的效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：液相色譜儀：Waters 2695/PDA 檢測器2996；液質(zhì)聯(lián)用儀：AcquityTM UPLC；Quattro Premier XE QQQ（Waters 公司）。試劑：HPLC：水為純化水，乙腈、四氫呋喃為色譜純；UPLC-MS/MS：水為娃哈哈純凈水，乙腈為農(nóng)殘級（Dikma 公司）；醋酸地塞米松、醋酸可的松、醋酸潑尼松龍、醋酸潑尼松、醋酸氫化可的松、醋酸曲安奈德、潑尼松龍、潑尼松、倍他米松、醋酸氟輕松、氫化可的松、丙酸倍氯米松、丙酸氯倍他索、曲安奈德、地塞米松、氯氟舒松、甲潑尼龍、曲安西龍、丁酸氫化可的松對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 測定方法

1.2.1 HPLC-PDA 法

1.2.1.1 色譜條件 柱：Waters Sunfire（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 ml/min；流動相：梯度洗脫，見表1：柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μl，檢測波長240 nm。

表1 HPLC-PDA 法的梯度洗脫

1.2.1.2 測定方法 取上述19 種對照品，加甲醇制成約0.5 μg/ml 的溶液，作為混合對照品溶液。精密量取5 μl 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。各組分中除潑尼松龍、氫化可的松未完全分離外（分離度1.3），其余均能達(dá)到完全分離。各物質(zhì)的分離圖譜及紫外光譜圖見圖1。

圖1 HPLC-PDA 法色譜圖

1.2.2 UPLC-MS/MS 法

1.2.2.1 色譜及質(zhì)譜條件 色譜方法：流動相：為程序洗脫，見表2；流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；C18 柱：Waters Xterra MS C18 150 mm×2.1 mm，5 μm。質(zhì)譜方法：電噴霧接口，正離子檢測模式，毛細(xì)管電壓：3.00 KV，錐孔電壓：35.00 V，源溫：105 ℃，脫溶劑溫度：350 ℃，脫溶劑氣N2：400 L/h；錐孔氣：50 L/h。

表2 UPLC-MS/MS 法的程序洗脫

1.2.2.2 測定方法 取曲安西龍、潑尼松、甲潑尼龍（潑尼松龍、氫化可的松）、倍他米松（地塞米松）、曲安奈德、醋酸潑尼松龍、醋酸氫化可的松、醋酸潑尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸曲安奈德、醋酸氟輕松、氯氟舒松、丙酸氯倍他索及丙酸倍氯米松18 種對照品，分別加入甲醇制成約0.05 μg/ml 的溶液，做二級質(zhì)譜找到各物質(zhì)的分子離子峰和碎片峰，用質(zhì)譜檢測器中可用多級反應(yīng)模式（MRM）進(jìn)行檢測，見表3；再將18 種對照品用甲醇制成約0.05 μg/ml 的混合溶液作為混合對照品溶液。精密量取3 μl 注入液相質(zhì)譜儀，記錄質(zhì)譜圖。

表3 18 種對照品的母離子與子離子情況

2 結(jié)果

由于丁酸氫化可的松的質(zhì)譜響應(yīng)較低，故未檢測；18 種物質(zhì)中除丙酸倍氯米松為ESI+外其余均為ESI-；醋酸地塞米松和曲安奈德雖母離子相同，但子離子不同，且保留性能不同，可以進(jìn)行區(qū)分；潑尼松龍、氫化可的松與甲潑尼龍重合，地塞米松與倍他米松重合，但因各自的母離子和子離子均不相同，在質(zhì)譜檢測器中可用多級反應(yīng)模式（MRM）進(jìn)行分別檢測，不會造成干擾，見圖2。

圖2 UPLC-MS/MS 法分離圖譜

3 討論

HPLC 法分離性能好、靈敏度高且操作快速簡便，是臨床常用的檢測方法之一，本研究首先采用HPLC 法快速篩選19 種腎上腺皮質(zhì)激素。由于不同腎上腺皮質(zhì)激素的結(jié)構(gòu)、紫外光譜圖均類似，最大吸收波長在239～244 nm 范圍內(nèi)，故本研究選擇240 nm 波長進(jìn)行測定，可兼顧所測定的19 種物質(zhì)。

超高效液相色譜（UPLC）是基于傳統(tǒng)的HPLC 技術(shù)上發(fā)展起來的，但UPLC 的檢測效率及靈敏度均較高，分離能力較強(qiáng)［4］。UPLC-MS/MS 也因質(zhì)譜特有的檢測方式而不同于HPLC-PDA，液質(zhì)聯(lián)用的特點是離子碎片特征性強(qiáng)，提供的信息豐富。質(zhì)譜串聯(lián)檢測器可采用二級子離子做定量離子，利用MRM 進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量，可極大提高檢測靈敏度。利用其MS 的特征離子峰，地塞米松的母離子/子離子為437/361，倍他米松為391/361，甲潑尼龍為373/343，潑尼松龍為359/329，氫化可的松為361/331，故當(dāng)?shù)厝姿膳c倍他米松、甲潑尼龍與潑尼松龍及氫化可的松在紫外圖（或總離子流圖）相重合時，利用質(zhì)譜檢測器能提取出單個物質(zhì)的質(zhì)譜圖進(jìn)行積分，且不受其他物質(zhì)的干擾。

在日常生活中，常采用化學(xué)、薄層、紫外和HPLC 法進(jìn)行鑒別偽劣產(chǎn)品，本研究通過HPLC-PDA 法確定色譜的保留時間及紫外光譜中最大吸收峰位置是否一致，可初步判斷是否存在19 種腎上腺皮質(zhì)激素中的物質(zhì)，但是保留時間與紫外光吸收圖譜只能從一方面認(rèn)為可能是同一物質(zhì)，只有通過不同類型的方法才能真正確定而不會誤判，所以本研究最終采用UPLC-MS/MS 法進(jìn)行確證。質(zhì)譜檢測器是檢測物質(zhì)的質(zhì)荷比的，與紫外檢測器是完全不同的方法。通過兩種方法均確定為同一物質(zhì)的時候才能下結(jié)論。

本研究采用HPLC-PDA 法及UPLC-MS/MS 法測定19 種腎上腺皮質(zhì)激素，可鑒定藥物制劑、中藥及體液中的多種皮質(zhì)激素，且不受基質(zhì)及賦形劑等的干擾，可使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠，可廣泛用于對中藥、保健品或化妝品添加西藥成分、食品中殘留激素及體育中使用違禁藥品等的檢測。