免疫組化雙染SF-1/DOG1對不育癥患者睪丸活檢細(xì)胞的輔助診斷

武良美，袁 菊，王 璇，鞏 雪，馬恒輝，陸珍鳳，陳 輝

睪丸活檢病理學(xué)診斷是診斷不育癥患者睪丸中精子發(fā)生狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)，其主要臨床意義是判斷梗阻性無精子癥或非梗阻性無精子癥[1]。前者是指睪丸能夠產(chǎn)生精子，但輸精管道阻塞，精子無法順利排出，可通過實行外科手術(shù)解除梗阻；后者是指睪丸不能產(chǎn)生或產(chǎn)生少量的不成熟的精子，必須通過現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)，改善患者的生殖水平[2-3]。本文探討常規(guī)福爾馬林固定的睪丸活檢細(xì)胞，經(jīng)SF-1/DOG1免疫組化雙染與HE染色比較，讓病理醫(yī)師對睪丸生殖細(xì)胞成熟階段的形態(tài)學(xué)特征有了更為直觀的認(rèn)識，從而對不育癥患者組織學(xué)分類、治療措施的選擇和預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014～2018年中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院病理科及江蘇省南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院篩選的28例無精子癥男性睪丸活檢標(biāo)本。患者有關(guān)臨床參數(shù)和精子回收率的信息通過查看電子病歷獲得。

1.2 組織切片制備及HE染色活檢組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，行常規(guī)HE染色。

1.3 組織學(xué)分型依據(jù)阿克曼外科病理學(xué)睪丸生殖病理(第10版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，按形態(tài)學(xué)分為5種組織學(xué)類型：(1)生精小管廣泛玻璃樣變，定義為包括廣泛硬化的所有生精小管，沒有可識別的生殖細(xì)胞或支持細(xì)胞；(2)唯支持細(xì)胞綜合癥，指生精小管中沒有任何成熟程度的生殖細(xì)胞，只有支持細(xì)胞存在；(3)成熟遲滯型，以存在生殖細(xì)胞為特征，但未成熟(即沒有可識別的細(xì)長精子細(xì)胞)；(4)精子發(fā)生低下，定義為活檢組織有精子發(fā)生，但程度有所降低(即生殖細(xì)胞成熟進展到晚期精子細(xì)胞，生精小管數(shù)量減少)；(5)生精功能正常。

1.4 免疫組化采用免疫組化雞尾酒雙染法染色，DOG1抗體(1 ∶25稀釋)購自Cell Marque公司；SF-1抗體(1 ∶50稀釋)購自R&D公司；免疫組化雙染檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司。實驗步驟：(1)3 μm厚石蠟切片置于二甲苯和乙醇中脫蠟水洗；(2)高壓鍋中加入免疫組化抗原修復(fù)液，購自福州邁新公司(檸檬酸法)，高溫高壓修復(fù)5 min；(3)滴加免疫雙染檢測試劑盒試劑1(內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑)50 μL，室溫孵育10 min，水洗畫圈，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(4)滴加DOG1抗體試劑50 μL，37 ℃孵育100 min，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(5)滴加SF-1抗體試劑50 μL，37 ℃孵育100 min，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(6)滴加50 μL免疫雙染檢測試劑盒試劑2(即用型組合二抗，即HRP標(biāo)記抗兔IgG+AP抗小鼠HRP)，37 ℃孵育30 min，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(7)滴加50 μL免疫雙染檢測試劑盒試劑3，室溫孵育10～15 min，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(8)滴加50 μL免疫雙染檢測試劑盒試劑4，室溫孵育5～10 min，自來水沖洗；(9)蘇木精染色液室溫染色0.5～1 min，自來水沖洗干凈，返藍晾干，切勿乙醇脫水；(10)透明、中性樹膠封固。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征28例男性不育癥患者，平均年齡28歲(范圍24～39歲)?；顧z前精液分析顯示23例(82%)精子計數(shù)為0(無精子癥)，其余5例(18%)為極罕見精子(少精子癥)。原發(fā)性不育癥23例(82%)，繼發(fā)性不育5例(18%)。臨床病史包括克氏綜合征6例(21%)，精索靜脈曲張7例(25%)，伴雙側(cè)隱睪史的促性腺功能低下2例(7%)，雙側(cè)附睪梗阻3例(11%)，既往睪丸炎2例(7%)，既往附睪炎3例(11%)。

2.2 病理檢查組織學(xué)診斷包含3例(11%)精子生成正常患者，7例(25%)精子生成低下患者，3例(11%)精原細(xì)胞成熟遲滯患者，14例(50%)唯支持細(xì)胞綜合征患者和1例(4%)伴廣泛生精小管玻璃樣變患者。所有活檢組織生精小管細(xì)胞按免疫組化雙染結(jié)果分為2種(表1)。(1)SF-1+/DOG1+：在正常精子發(fā)生(圖1)、精子生成不足(圖2)和成熟遲緩標(biāo)本中(圖3)均呈雙重陽性；(2)SF-1+/DOG1-：在唯支持細(xì)胞綜合征中DOG1陰性，僅SF-1陽性(圖4)。根據(jù)免疫組化雙染結(jié)果顯示：在正常精子發(fā)生、精子生成不足和成熟遲緩這些病例中DOG1的陽性程度是由高到低的。

表1 不育癥的形態(tài)學(xué)特征及免疫表型

①A①B②A②B③A③B④A④B

3 討論

全世界不孕不育癥患者有6 000萬～8 000萬對夫婦，其中40%～50%的不孕是由男性因素造成的[4]。梗阻性無精子癥有時可以通過手術(shù)得到緩解，而在非梗阻性無精子癥患者中，如果沒有輔助生殖技術(shù)生育能力通常無法實現(xiàn)。從非梗阻性無精子癥患者睪丸成功取出精子的可能性取決于活檢的相關(guān)組織學(xué)類型。

盡管睪丸活檢很重要，但是病理醫(yī)師的診斷仍然存在顯著差異性，比如Cooperberg等[5]在重新檢查113例睪丸活檢切片中發(fā)現(xiàn)，原始診斷和重新檢查時的診斷之間的一致性僅為中等。因此，病理醫(yī)師對精子形成的質(zhì)量和程度的評估，依賴于鮮明的細(xì)胞核著色和生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性這兩個形態(tài)學(xué)特征。遺憾的是，10%中性福爾馬林固定雖然可以更方便地固定標(biāo)本，但睪丸活檢組織細(xì)胞的核著色相對較差，存在細(xì)胞收縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)脫落的問題，因此僅依靠睪丸活檢的常規(guī)HE染色，病理醫(yī)師很難評估生殖細(xì)胞的成熟程度。Bouin固定液對細(xì)胞核著色鮮明，并保持精小管結(jié)構(gòu)的完整性等優(yōu)點，但是它會造成毒性和處理問題，因此，國內(nèi)不常用[6-8]。

DOG1抗體最近被發(fā)現(xiàn)在生殖細(xì)胞中表達，特別是精原細(xì)胞和精子細(xì)胞。Osman等[9]研究發(fā)現(xiàn)雖然DOG1在精原細(xì)胞瘤中不著色，但它在正常輸精管中的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中表達。另Salama等[10]在2015年美國和加拿大病理學(xué)年會上發(fā)表的將DOG1免疫組化染色技術(shù)應(yīng)用于40例不育癥睪丸活檢，發(fā)現(xiàn)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞染色。利用Salama等的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合SF-1在所有的激素樣細(xì)胞組織中的表達作用(特別是腎上腺皮質(zhì)、睪丸支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞)[11]，本實驗設(shè)計了SF-1/DOG1免疫組化雙染法，用以鑒定患者的生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。

綜上所述，SF-1/DOG1免疫組化雙染對比常規(guī)HE染色可以更直觀的幫助病理醫(yī)師解釋福爾馬林固定睪丸活檢組織的形態(tài)學(xué)特征，并且可以從免疫組化雙染結(jié)果中獲益，幫助不育癥患者的分類，從而使患者和臨床醫(yī)師能夠更好地了解輔助生殖技術(shù)的后續(xù)使用情況。