不同采摘月份木姜子果揮發(fā)性成分測定*

周麗免，李 佳，樊愛萍 ，白忠彬

(1.云南農業(yè)大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.紅河學院 理學院，云南 蒙自 661100)

木姜子(Litsea euosmaW.W.Smith)，又名山蒼子，為樟目(Laurales)樟科(Lauraceae)木姜子屬(LitseaLam.)的常綠或落葉喬木或灌木植物[1]，主要分布于亞洲的熱帶和亞熱帶，中國主產于南方及西南溫暖地區(qū)[2]。木姜子多生于海拔300～3 200 m 的向陽坡地、灌木叢、稀疏林、林中路旁和水邊[3]。目前，中國部分省份已人工營造木姜子林，其中以福建、湖南和四川等省營造面積最大[4]。木姜子中的化學成分主要有生物堿、脂肪酸和木質素等，它們存在于植株的根、莖、葉、果實、花及種子等器官和組織中，且不同部位其化學成分的組成和含量差異較大[5]。在傳統(tǒng)中藥學上，木姜子的根、莖、葉、樹皮和果實皆可入藥，具有清熱解毒等功效，并可預防和治療類風濕性關節(jié)炎[6]。SEAL 等[7]研究表明：木姜子揮發(fā)油可以誘導細胞凋亡和細胞周期停滯，進而對人類非小細胞肺癌有一定的療效。

木姜子揮發(fā)油有特殊的清香氣[8]，民間有作為食品香料應用的先例，但木姜子油提取商業(yè)化程度低，不同月份木姜子油的揮發(fā)性成分富集規(guī)律變化未見研究報道。目前對木姜子的研究主要是對其葉、花和果實揮發(fā)油化學成分的分析[5]，然而由于木姜子的化學成分和生物活性可能隨果實生長過程而變化，因此采摘時間會影響其精油的產量和質量[9-11]。因此，本研究通過油浸提(熱浸提和冷浸提)、超聲波輔助浸提和水蒸氣蒸餾3 種方法提取木姜子精油，并確定最佳提取方法；采用最佳提取方法提取5、6 和7 月的木姜子果精油，運用氣相色譜?質譜聯(lián)用儀對其化學成分進行分析，比較5、6 和7 月木姜子果揮發(fā)性成分的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮清香木姜子果采自云南省紅河州蒙自市期路白鄉(xiāng)。5 月木姜子果(簡稱“5 月果”)處于幼果時期，果實近球形，直徑約1～1.5 mm，綠色，果梗長約3 mm，先端不增粗；6 月木姜子果(簡稱“6 月果”)處于幼果與成熟果的過渡階段，果實近卵球形，綠色，有白色小點，直徑約2～3 mm，果梗長約4 mm，先端不增粗；7 月木姜子果(簡稱“7 月果”) 為晚年成熟期，果扁球形，直徑約5～6 mm，藍黑色，果梗長約5～6 mm，上部稍肥大，有稀疏短柔毛。

1.2 試驗方法

1.2.1 木姜子精油的制備

(1) 植物油熱浸提

選擇顏色正常、大小均勻、無雜質霉變(即新鮮的、成熟度一致)的木姜子鮮果，采用分析天平準確稱取20.0 g 置于裝有50.0 mL 玉米胚芽油的250 mL 圓底燒瓶進行浸提，采用溫度計進行控溫，油溫控制在80～90 ℃，提取時間20 min。待溫度降至室溫，采用6 層紗布過濾提取液，在濾液中加入5.0 g 無水硫酸鈉(Na2SO4)除去提取液中的水分，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 植物油常溫冷浸提

采用分析天平準確稱取新鮮且成熟度一致的木姜子鮮果20.0 g，置于裝有50.0 mL 玉米胚芽油的燒杯中，常溫浸提20 min。采用6 層紗布過濾提取液，在濾液中加入5.0 g 無水硫酸鈉(Na2SO4)除去提取液中的水分，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3) 超聲波輔助溶劑萃取法(UAE)

選擇新鮮且成熟度一致的木姜子鮮果，按木姜子鮮果∶玉米胚芽油=20.0 g∶50.0 mL 的料液比置于帶蓋的不銹鋼杯中，用超聲波儀器在超聲頻率100 kHz、振幅0.6 A、水浴溫度35～50 ℃條件下進行水浴浸提，提取時間60 min。采用6 層紗布過濾提取液，在濾液中加入5.0 g 無水硫酸鈉(Na2SO4) 除去提取液中的水分，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹12]。

(4) 水蒸氣蒸餾法

挑選顏色正常、大小均勻、無雜質和霉變且成熟度一致的新鮮木姜子果40.0 g，按照料液比1∶4 (g∶mL)加入蒸餾水160 mL，置于250.0 mL圓底燒瓶中；將圓底燒瓶接入蒸餾裝置進行加熱，待木姜子和蒸餾水混合液沸騰后，將電爐調節(jié)至微沸，使冷凝液滴下的速度約為1 滴/s，回流提取3 h；蒸餾完畢后，關閉電爐，待裝置冷卻后，收集淺黃色透明提取液，其氣味芬芳濃郁。將提取液與50 mL 玉米胚芽油混合，并加入5.0 g 無水硫酸鈉 (Na2SO4)除水，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.2 GC-MS 分析條件

通過GC-MS 檢測條件優(yōu)化，具體操作如下：

(1) 色譜條件：色譜柱Rtx-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純度He，流速5 mL/min，分流比20∶1，進樣量1 μL，進樣口溫度保持250 ℃。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min速率升至220 ℃，保持2 min。溶劑延遲時間3 min。

(2) 質譜條件：EI 離子源溫度250 ℃；電離電壓88 eV；質量吹掃范圍：35～500 m/z。

(3) 靜態(tài)頂空條件：進樣針體積2.5 mL；進樣體積500 μL；振蕩箱溫度100 ℃；振蕩時間20 min；進樣針溫度80.0 ℃；補償時間1 s；進樣速度500 μL/s；氣體吹掃時間120 s。

1.2.3 木姜子精油含量的測定

比較1.2.1 節(jié)中4 種木姜子精油制備的效果，測定選擇最佳制備方法的木姜子出油率。

出油率=精油質量/木姜子鮮果質量×100%。

1.2.4 化學成分定性及定量分析

將3 個采摘期的木姜子精油樣品及未經處理玉米胚芽油分別用移液槍吸取1 mL 樣品裝入20 mL 頂空進樣瓶，進樣量為1 μL，于GC-MS進行測定。通過HP MSD 化學工作站等手段檢索WILFYT/SWTLIBRARY/PESTICD/NIST 147/NIST 05 標準質譜的圖庫，同時結合質譜相關數(shù)據(jù)庫資料[14-16]，通過雙重標準(化合物出峰保留時間和化合物的質譜圖)定性，確定木姜子精油揮發(fā)性物質的可鑒別化學成分，采用峰面積歸一化法定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Excel 2016 分別對5、6 和7 月果實揮發(fā)性成分含量、保留時間和離子峰強度進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Origin 8.5 作圖，Adobe Illustrator CS6 進行圖片處理。

2 結果與分析

2.1 木姜子精油制備方法的比較

由圖1 可知：水蒸氣蒸餾法提取的精油經GC-MS 檢測出峰最多，揮發(fā)性成分豐度較佳，水蒸氣蒸餾法提取木姜子精油效果最佳，故本研究采用水蒸氣蒸餾法提取5、6 和7 月果木姜子精油。

2.2 精油含量

清香木姜子5、6 和7 月果的精油提取率分別為0.50%、3.03% 和5.53%，說明精油含量隨著果實成熟度的生長而增加，風味也越發(fā)濃郁飽滿。

2.3 木姜子精油揮發(fā)性成分的GC-MS 分析

由圖2、表1 可知：經氣質檢測，采用頂空固相微萃取從木姜子5 月果精油樣品中共注冊100 個峰，即檢測到100 種成分，共鑒定出32 種化合物，占檢出總量的78.36%。其中，萜烯類化合物17 種，占總量的45.97%；醇類化合物4 種，占總量的26.14%；酮類化合物1 種，占總量的0.85%；醛類7 種，占總量的4.38%；烷烴類2 種，占總量的0.29%；胺類1 種，占總量的0.72%。含量超過1% 的有10 種，占總含量的74.39%；含量最高的組分為雙戊烯(26.87%)，其次為芳樟醇(18.87%)。

圖1 不同加工方法提取木姜子精油總離子流Fig.1 Total ion chromatograms of essential oil extracted from L.euosma by different processing methods

圖2 不同采摘月份木姜子精油總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of L.euosma essential oil in different picking months

由圖2、表2 可知：經氣質檢測，采用頂空固相微萃取從木姜子6 月果精油樣品中共注冊100 個峰，即檢測到100 種成分，共鑒定出49 種化合物，占檢出總量的87.49%。其中，萜烯類化合物14 種，占總量的33.29%；醇類化合物7種，占總量的5.49%；酮類化合物2 種，占總量的3.31%；醛類16 種，占總量的34.39%；烷烴類4種，占總量的1.76%；胺類1 種，占總量的5.45%；新增加酸類4 種，占總量的2.8%；酯類1 種，占總量的1%。其中含量超過1%的有22 種，占總含量的95.08%；含量最高的組分為雙戊烯和檸檬烯，均為14.61%。

由圖2、表3 可知：經氣質檢測，采用頂空固相微萃取從木姜子7 月果精油樣品中共注冊100 個峰，即檢測到100 種成分，共鑒定出98 種化合物，占總檢出量的98.04%。其中，萜烯類化合物19 種，占總量的14.54%；醇類化合物26 種，占總量的15.39%；酮類化合物13 種，占總量的5.95%；醛類19 種，占總量的53.74%；烷烴類4 種，占總量的2.84%；酸類5 種，占總量的1.98%；酯類6 種，占總量的2.54%。7 月果中新增加呋喃類3 種，占總量的1.54%；銨類1 種，占總量的1.29%；酚類1 種，占總量的0.16%，在7 月果中未檢出胺類成分。其中含量超過1%的有25 種，占總含量的85%；含量最高的組分為檸檬醛(15.89%)。

表1 木姜子5 月果精油樣品化學成分Tab.1 Chemical constituents of essential oil from the fruits of L.euosma harvested in May

2.4 不同采摘月份木姜子果的同種化學成分分析

由表4 可知：隨著果實的成熟，木姜子5、6、7 月果中的萜烯類(如β-蒎烯和雙戊烯等)和醇類(如桉葉油醇和芳樟醇)物質含量總體呈減少趨勢；醛類(如檸檬醛)和酮類(如甲基庚烯酮)物質含量總體呈增加趨勢。感官上揮發(fā)性成分風味也越來越濃郁，留香時間更長，表明同種揮發(fā)性成分變化與果實成熟度正向相關。

3 討論

從化學成分來看，木姜子5 月果中鑒定出32種化合物，占檢出總量的78.36%。揮發(fā)油組成主要包括萜烯類、醛類、醇類和酮類。其中主要成分為萜烯類(45.97%)和醇類(26.14%)。5 月果揮發(fā)油成分萜烯類物質含量較高。萜烯類具有很強生物活性，被認為是解毒和溢出代謝的產物，被證實是對其他生物的驅避劑或引誘劑，使得人們相信萜烯在有機體之間的拮抗或互惠作用中起著重要作用[17]。用它制成的藥可以驅蟲，且對植物的生長具有重要作用。因此，若想要以木姜子萜烯類及醇類精油揮發(fā)性成分作為功效治療時建議采用5 月果實。6 月果精油中共鑒定出49 種化合物，占檢出總量的87.49%。揮發(fā)油組成主要有：萜烯類、醛類、醇類、酮類、酸類和酯類。其中主要成分為萜烯類(33.29%) 和醛類(34.39%)。6 月采摘的木姜子在果實感官品質上優(yōu)于5 月果。6 月果中，萜烯類物質種類增加，但含量低于5 月果，致使其中萜類氣味及藥味等不良氣味減少，其中醛類物質種類及含量豐富。萜烯類及醛類物質具有很好的抗氧化作用，也是很好的香辛料成分[18-19]。因此，若想以醛類和萜烯類精油揮發(fā)性成分作為研究對象時，建議采用6 月采摘的木姜子果。7 月果精油中共鑒定出98 種化合物，占檢出總量的98.04%。揮發(fā)油組成主要有：萜烯類、醛類、醇類、酮類、酸類、酯類、酚類、呋喃類、乙酐和乙酸銨等組分，主要成分有醛類(53.84%)和醇類(15.39%)。7 月果的萜烯類含量遠遠低于5 月果，出現(xiàn)新的化合物，從化學族種類及含量上更加飽滿；揮發(fā)性成分更加復雜多樣，感官上風味更加濃郁，香味越發(fā)飽滿，香味濃烈且留香較長。木姜子7 月果揮發(fā)性成分中醛類化學族占比量較大，其中檸檬醛含量豐富(15.89%)，其具有檸檬的香氣，是重要的香料，也是合成紫羅蘭酮的主要原料，同時具有平喘和抗菌功效[20-21]。另外，揮發(fā)油中的香葉醇、橙花醇，具有玫瑰的香氣，也是重要的香料。因此，若想要更好地研究醛類物質的功效或者應用于食品添加劑和香料開發(fā)，建議采摘7 月的木姜子果實。

表2 木姜子6 月果精油樣品的化學成分Tab.2 Chemical constituents of essential oil from the fruits of L.euosma harvested in June

從化合物類型來看，在木姜子果實的揮發(fā)油中，單萜類化合物為最主要的成分。單萜類化合物是存在于植物界的一類化合物，其生物活性是多方面的，并且是某些中藥的主要有效成分。如在木姜子果實的精油中的主要單萜類化合物有檸檬醛、甲基庚烯酮、檜烯、檸檬烯、芳樟醇、月桂烯、香茅醛和蒎烯等活性有效成分，分別具有驅蟲、鎮(zhèn)痙、平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗菌和抗病毒等作用[22]。此外，其果實的精油還含有倍半萜化合物類型的組分，且精油中某些萜類合成的酶基因部分功能已被證實[23]。萜類化合物具有廣譜的藥理活性和較低毒性，已成為國內外天然藥物開發(fā)利用研究的熱點[24-25]，據(jù)文獻報道萜類化合物還具有抗艾滋病毒和抗腫瘤等較強生物活性[26]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎和抗菌等作用[27]。生物活性的變化取決于精油的組成，因此，精油的生物活性可能取決于它的采收時節(jié)及生存環(huán)境。由于試驗周期的緣故，本研究的重點在于3 個采摘月份木姜子果化學成分的提取及分析，與大萼木姜子[28]及木姜子[29]揮發(fā)油的化學成分比較，該研究結果中清香木姜子揮發(fā)油組成有很大區(qū)別，這說明木姜子在藥用選材中必須考慮其種類及產地，才可以充分保證其藥用功效的發(fā)揮。清香木姜子揮發(fā)油是否和木姜子屬其他植物一樣具有抗菌作用，以及其效果如何還有待于進一步研究。

表3 木姜子7 月果精油樣品化學成分Tab.3 Chemical constituents of essential oil from the fruits of L.euosma harvested in July

表4 不同采摘月份木姜子精油同種揮發(fā)性成分變化Tab.4 Changes of volatile components of the same kinds of essential oil from L.euosma in different picking months

4 結論

(1) 水蒸氣蒸餾法更適宜本研究提取木姜子精油，適宜工藝條件為：料液比1∶4，提取時間3 h，5、6 和7 月果的精油提取率分別為0.50%、3.03%和5.53%。

(2) 應用頂空進樣固相微萃取技術提取清香木姜子新鮮果實揮發(fā)性組分，經GC-MS 技術檢測，5、6、7 月果的化學成分分別為32、49 和98 種，分別占揮發(fā)性組分總量的77.29%、87.49%和98.04%。5 月果的主要化學成分是萜烯類化合物；6 月果中萜烯類化合物含量不及5 月果，但種類增多，且新出現(xiàn)了油酸、正十五酸和丙氨酸乙酯等化合物；7 月果的萜烯類化合物含量減少，醛類物質種類和含量增加，出現(xiàn)香芹酚、乙酐、乙酸銨和呋喃類等新化合物。