腹腔穿刺引流對重癥急性胰腺炎大鼠腸道TLR4表達(dá)的影響及意義

黃尚卿，文藝，王冰，李帥，原小惠，孫紅玉，湯禮軍*

1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610031；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心/四川省胰腺損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗室，成都 610083；3西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗室，成都 610083

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是以胰腺廣泛炎癥反應(yīng)伴組織壞死為主要特征，且病情進(jìn)展迅速的急癥，病死率高達(dá)15%～25%[1]。在S A P 早期，失控的全身炎癥反應(yīng)所造成的多器官損傷是患者死亡的主要病理生理基礎(chǔ)，其中胰腺炎相關(guān)腸道損傷(pancreatitis-associated intestinal injury，PAII)是SAP早期病程中最常見的胰外并發(fā)癥，與SAP的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[2]。 據(jù)報道，腸道尤其是小腸不僅是SAP進(jìn)程中的受累器官，更是全身炎癥反應(yīng)發(fā)生的助推器[3]。因此，積極預(yù)防PAII的發(fā)生或減輕其損傷程度是SAP治療的重要環(huán)節(jié)。本課題組前期研究證實(shí)，早期實(shí)施腹腔穿刺引流(abdominal paracentesis drainage，APD)排出含有多種毒性物質(zhì)的胰腺炎相關(guān)腹水(pancreatitis associated ascite fluid，PAAF)能明顯減輕全身炎癥反應(yīng)程度，改善腸屏障功能[4-5]，但目前該腸道保護(hù)作用的機(jī)制認(rèn)識仍十分有限，亟待進(jìn)一步研究。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是哺乳動物體內(nèi)模式識別受體家族的重要成員，也是傳遞細(xì)胞外抗原信息并觸發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白。近期研究表明，TLR4在SAP炎癥反應(yīng)的啟動和器官損傷中均發(fā)揮著重要作用，可通過依賴髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)途徑激活NF-κB炎癥信號通路，從而參與PAII的發(fā)生與發(fā)展[6]?；诖耍狙芯刻接懺缙趯?shí)施APD對腸道TLR4表達(dá)的影響及意義，以期為進(jìn)一步深入了解APD的作用機(jī)制提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 95%純度牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒、紫外比色法試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TUNEL試劑盒、SP免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；RNA提取試劑、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；一步法PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；兔抗大鼠TLR4多克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體購自英國GeneTex公司；兔抗大鼠Myd88、NF-κB p65、Bax單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體購自德國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔和抗小鼠二抗購自武漢Proteintech公司。動物麻醉機(jī)及動物用異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 實(shí)驗分組及模型制備 SPF級雄性SD大鼠45只，8～9周齡，體重190～210 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗動物有限公司。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，禁飲6 h，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、SAP組與APD組，每組15只。按照本團(tuán)隊既往報道的方法[7]建立SAP大鼠模型，即大鼠麻醉后，開腹尋找十二指腸降段，充分暴露膽胰管開口，將1 ml注射器針頭在成功穿刺進(jìn)入胰膽管后用動脈夾固定。采用微量輸液泵向膽胰管輸入5%牛磺膽酸鈉溶液，劑量0.1 ml/100 g，輸注速率12 ml/h，壓力維持時間10 min，完成后腹腔注射頭孢唑林鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，劑量50 mg/kg)并關(guān)腹。Sham組大鼠在麻醉后開腹找到胰腺組織，翻動數(shù)次后關(guān)腹。APD組大鼠在成功制備SAP模型后，于右下腹接入引流管并固定于腹壁，外套金屬彈簧圈，引流管外接負(fù)壓吸引球。所有大鼠在建模后均于背部皮下多點(diǎn)注射溫生理鹽水(5 ml/100 g)，禁食不禁水。建模后24 h處死大鼠，采集血樣、胰腺和小腸組織(末段回腸)。本研究經(jīng)西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)，實(shí)驗過程符合國家動物實(shí)驗指導(dǎo)原則的相關(guān)規(guī)定。

1.3 小腸和胰腺組織病理學(xué)檢測 小腸和胰腺組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h后，梯度脫水、透明、石蠟包埋、切片，厚度4 μm，行HE染色。由兩位病理科醫(yī)師在光鏡下觀察小腸和胰腺組織病理學(xué)變化，并采用雙盲法進(jìn)行病理評分。胰腺組織病理評分參照Schmidt等[8]的方法，小腸組織病理評分參照Chiu等[9]的方法。

1.4 血清淀粉酶、脂肪酶活性及腸道損傷相關(guān)指標(biāo)、血清和小腸組織炎性因子水平檢測 血清淀粉酶、脂肪酶活性采用深圳邁瑞生物獸用全自動生化分析儀檢測；血清二胺氧化酶(DAO)活性采用紫外比色法檢測，血清D-乳酸、內(nèi)毒素以及血清和小腸組織TNF-α、IL-6水平采用ELISA法測定，均嚴(yán)格按照說明書步驟操作。

1.5 TUNEL法檢測腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況 小腸組織石蠟切片經(jīng)梯度脫蠟水化后，采用TUNEL法檢測腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況，嚴(yán)格按照說明書步驟操作。熒光顯微鏡下觀察并計算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 RT-PCR檢測小腸組織TLR4 mRNA的表達(dá)水平 采用TRIzol法提取小腸組織總RNA，并用分光光度儀檢測RNA的含量和純度，A260/A280比值在1.8～2.1的樣本符合實(shí)驗要求。按照一步法RT-PCR試劑盒要求配制25 μl反應(yīng)體系進(jìn)行目標(biāo)序列擴(kuò)增，采用Bio-Rad CFX軟件分析TLR4 mRNA的表達(dá)水平變化。引物序列由上海生物工程有限公司合成 (表1)。

表1 PCR引物序列及反應(yīng)條件Tab.1 Primer sequences and reaction conditions used in PCR

1.7 免疫組化法檢測小腸組織TLR4蛋白的表達(dá) 小腸組織石蠟切片經(jīng)梯度脫蠟水化后，經(jīng)抗原修復(fù)、兔抗大鼠TLR4多克隆抗體(1:400)和山羊抗兔二抗(1:1000)孵育后，用免疫組化試劑盒進(jìn)行染色，嚴(yán)格按照說明書步驟操作。采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行光密度值分析。

1.8 Western blotting檢測小腸組織TLR4信號通路關(guān)鍵蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 按照試劑盒說明書操作，提取小腸組織總蛋白并測定總濃度，經(jīng)常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入抗TLR4(1:500)、MyD88(1∶2000)、p65(1:1000)、p-p65(1:1000)、Bax(1:2000)、Bcl-2(1:1000)、caspase-3(1:1000)和GAPDH(1:5000)一抗，4 ℃雜交過夜，次日加入二抗(1:5000)，經(jīng)化學(xué)發(fā)光后，應(yīng)用UVP BioSpectrum 410成像系統(tǒng)曝光并分析目的條帶光密度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(Tukey法)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 APD對胰腺組織病理損傷和胰腺炎血清指標(biāo)的影響 HE染色結(jié)果顯示，建模后24 h，Sham組大鼠胰腺組織大體結(jié)構(gòu)正常；SAP組胰腺組織水腫，腺小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)大片邊界不清的溶解壞死灶，炎性細(xì)胞浸潤明顯，病理評分明顯升高(P<0.05)；與SAP組比較，APD組胰腺組織病理改變明顯減輕，胰腺小葉大體結(jié)構(gòu)清晰，僅出現(xiàn)散在的點(diǎn)狀壞死灶，病理評分顯著降低(P<0.05， 圖1A、B)。同時，SAP組大鼠血清淀粉酶和脂肪酶活性以及TNF-α、IL-6水平較Sham組明顯升高，而APD組上述指標(biāo)較SAP組明顯降低(P<0.05，圖1C-F)。

2.2 APD對小腸組織病理改變和腸道損傷相關(guān)血清指標(biāo)的影響 HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)正常；與Sham組比較，SAP組大鼠小腸結(jié)構(gòu)和腸絨毛形態(tài)出現(xiàn)明顯異常，包括絨毛頂端剝落、黏膜和黏膜下腫脹、充血伴炎性細(xì)胞浸潤以及潘氏細(xì)胞中顆粒物增加，病理評分明顯升高(P<0.05)；與SAP組比較，APD組大鼠小腸病理改變明顯減輕(P<0.05，圖2A、B)。同時，SAP組大鼠血清D-乳酸、內(nèi)毒素水平以及DAO活性明顯升高，APD組上述指標(biāo)水平較SAP組明顯降低(P<0.05， 圖2C-E)。

2.3 APD對小腸組織TLR4、MyD88和NF-κB p65表達(dá)的影響 RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，建模后24 h，SAP組大鼠小腸組織TLR4 mRNA的表達(dá)水平較Sham組明顯升高，免疫組化和Western blotting檢測進(jìn)一步證實(shí)TLR4蛋白的表達(dá)水平也呈升高趨勢；APD干預(yù)后，TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平較SAP組明顯降低(P<0.05，圖3A-D)。伴隨TLR4表達(dá)水平的升高，SAP組MyD88蛋白的表達(dá)水平和 NF-κB p65的磷酸化水平也顯著升高，而APD組上述指標(biāo)較SAP組均明顯降低(P<0.05，圖3E、F)。

圖1 APD對大鼠胰腺組織病理損傷和胰腺炎血清指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of APD on the pathological injury of pancreatic tissue and serum markers of pancreatitis

圖2 APD對大鼠小腸組織病理改變和腸道損傷相關(guān)血清指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of APD on the pathological changes of small intestine and serum indexes related to intestinal injury

2.4 APD對小腸組織炎性因子表達(dá)和腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，與Sham組比較，SAP組大鼠腸黏膜炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，圖4A、B)。TUNEL法檢測結(jié)果顯示，SAP組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)較Sham組明顯增高，Western blotting檢測顯示促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達(dá)水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低(P<0.05，圖4C-H)。早期實(shí)施干預(yù)后，APD組大鼠腸黏膜炎性因子的表達(dá)和腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)較SAP組明顯降低，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白比例失衡明顯改善(圖4，P<0.05)。

圖3 APD對大鼠小腸組織TLR4、MyD88和NF-κB p65表達(dá)的影響Fig.3 Effects of APD on the expressions of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 in intestinal tissues

3 討 論

PAII是SAP早期最常見的胰腺外損傷之一。DAO特異性存在于哺乳動物腸黏膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，其在外周血中的基礎(chǔ)水平與腸黏膜的完整性呈明顯負(fù)相關(guān)[10]。本研究中，建模后24h即觀察到SAP組大鼠小腸黏膜的絨毛形態(tài)出現(xiàn)明顯異常，同時反映腸黏膜完整性和腸屏障功能的血清指標(biāo)，如DAO活性、D-乳酸和內(nèi)毒素水平均顯著升高，表明SAP大鼠模型伴有明顯的腸道損傷。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜屏障功能的損害及其介導(dǎo)的病理生理變化在SAP進(jìn)程中扮演著重要角色[11]。SAP造成的腸黏膜完整性破壞和通透性增加會導(dǎo)致細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，引起腸源性感染和膿毒癥，從而進(jìn)一步刺激已激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放大量炎性因子，促使全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的發(fā)生，并對胰腺及胰外其他器官造成“二次打擊”[2]。因此，積極預(yù)防PAII的發(fā)生或減輕其損傷程度是SAP治療的重點(diǎn)。

在SAP早期，腹腔內(nèi)可出現(xiàn)程度不等的PAAF，其在SAP進(jìn)程中的作用已逐漸被揭示[12]。一方面，PAAF中含有大量的消化酶、炎性介質(zhì)、游離脂肪酸等毒性物質(zhì)，不僅能刺激腹腔巨噬細(xì)胞合成和釋放大量促炎細(xì)胞因子，從而加重全身炎癥反應(yīng)，還能通過腹膜重吸收等途徑進(jìn)入外周血造成胰外器官損傷[13-14]；另一方面，PAAF的積聚會造成腹內(nèi)壓增高，致使腹腔間室綜合征(abdominal compartment syndrome，ACS)的發(fā)生風(fēng)險增加[15]。然而，目前相關(guān)的治療指南均未對PAAF提出指導(dǎo)性的處理意見。本團(tuán)隊前期的系列研究表明，通過APD及時去除PAAF是SAP治療中的重要環(huán)節(jié)，能減輕SAP的重癥化傾向，發(fā)揮保護(hù)重要臟器的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，早期實(shí)施APD治療能明顯減小SAP大鼠胰腺組織的壞死面積，減輕全身炎癥反應(yīng)的程度和小腸黏膜的病理改變，降低腸道損傷相關(guān)血清指標(biāo)的水平，表明APD具有顯著的腸屏障保護(hù)作用，但其潛在的分子機(jī)制目前尚不明確。

圖4 APD對大鼠小腸組織炎性因子表達(dá)和腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of APD on the expression of inflammatory factors and apoptosis of intestinal mucosal cells

TLR4是廣泛表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞表面的一種跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，也是模式識別受體家族的重要成員，在誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)中起著重要的樞紐作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4可通過MyD88途徑激活NF-κB炎癥信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成和釋放多種促炎細(xì)胞因子，引起炎癥正反饋的惡性循環(huán)，加重SAP及局部臟器的炎性損傷[18]。此外，Zheng等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，SAP時大鼠腸黏膜TLR4的表達(dá)水平明顯升高，而抑制其表達(dá)能顯著減輕PAII的程度，表明TLR4及其下游信號通路激活可能是PAII的重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，SAP組大鼠小腸黏膜TLR4明顯活化，這可能與發(fā)生SAP時外周血中高濃度的炎性細(xì)胞因子以及腸黏膜缺血缺氧密切相關(guān)。而下游激活的NF-κB信號通路可促使多種促炎細(xì)胞因子合成增加，致使小腸組織TNF-α和IL-6的表達(dá)水平明顯高于Sham組。經(jīng)APD治療后，SAP大鼠腸黏膜TLR4信號通路關(guān)鍵蛋白和炎性因子的表達(dá)明顯減少，提示APD可能通過抑制TLR4信號通路的激活，進(jìn)而減輕SAP引起的腸道炎癥反應(yīng)。另有研究報道，炎癥與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)，NF-κB信號通路的激活會造成調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)失衡，尤其是促凋亡蛋白caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞死亡的關(guān)鍵蛋白，其活化后的裂解產(chǎn)物會進(jìn)一步激活Caspase信號通路，最終引起細(xì)胞凋亡[20-21]。而腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡已被證實(shí)參與了SAP引起的腸黏膜屏障破壞和通透性增加[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著腸道炎癥反應(yīng)的加重，SAP大鼠腸黏膜促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達(dá)水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加。而在APD治療后，促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的失衡得到明顯改善，腸黏膜細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，進(jìn)一步提示APD對PAII的保護(hù)作用可能與減輕炎癥導(dǎo)致的腸黏膜細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明早期實(shí)施APD能顯著降低SAP大鼠腸道TLR4的表達(dá)，抑制下游NF-κB信號通路的激活，減輕小腸組織炎癥反應(yīng)程度，進(jìn)而減少腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡，以此發(fā)揮腸道保護(hù)作用。