熱休克蛋白在大鼠慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用及機制

趙彥芬，趙峰，劉鵬森，毛軻

河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，鄭州 450002

嗎啡是臨床上解除劇烈疼痛的主要藥物，也是全球使用量最大的強效鎮(zhèn)痛劑。然而，長期使用可能導致生理性嗎啡耐受，主要表現(xiàn)為患者在注射嗎啡后對疼痛的耐受減退甚至消失[1-2]。對于嗎啡耐受的患者，若要達到同等的鎮(zhèn)痛效果，需要更大劑量用藥，但會引起一系列不良反應(yīng)。越來越多的研究證實，小膠質(zhì)細胞活化和炎性因子的產(chǎn)生在嗎啡耐受形成過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。因此，尋找能夠安全有效地抑制小膠質(zhì)細胞活化和炎性因子產(chǎn)生的潛在靶分子對于治療嗎啡耐受具有重要意義。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類高度保守且廣泛表達的應(yīng)激蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)下表達顯著增加，可保護機體免于受損[5-6]。已有研究證實，嗎啡可以上調(diào)HSP60的表達[7]，但HSP60在嗎啡耐受中介導小膠質(zhì)細胞活化和炎癥反應(yīng)的作用尚不明確。本研究通過鞘內(nèi)注射siRNA-HSP60和嗎啡，觀察siRNA-HSP60對大鼠疼痛耐受、炎性因子表達、TLR4-p38 MAPK信號通路的影響，旨在探索HSP60在嗎啡耐受中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 鹽酸嗎啡購自沈陽第一制藥廠(批號：170406)；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；Prime Script試劑盒購自日本TaKaRa公司；OX-42抗體購自美國Abcam公司；FITC標記的抗羊熒光二抗購自美國Millipore公司；HSP60、Toll樣受體4(TLR4)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。恒溫水浴鍋購自北京市長風儀器儀表公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；多功能酶標儀購自美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗動物及分組 雄性SD大鼠由河南省中醫(yī)院動物中心提供，體重200～250 g。參照文獻[8]的方法鞘內(nèi)置管。麻醉大鼠后切開L4～L6背部皮膚，暴露L5～L6椎間隙，用8號針頭傾斜插入。在L5椎間隙插入充滿生理鹽水的Microspinal導管。腹腔注射青霉素40萬U以預(yù)防感染。大鼠鞘內(nèi)置管后恢復(fù)3 d，鞘內(nèi)注射2%利多卡因10 μl驗證置管是否成功，如大鼠雙后肢出現(xiàn)短暫癱瘓則為鞘內(nèi)置管成功，否則為失敗。采用隨機數(shù)字表法將50只鞘內(nèi)置管成功的大鼠分為對照組(n=10)、嗎啡組(n=10)、siRNA-陰性對照(siRNA-NC)+嗎啡組(n=10)、siRNA-HSP60+嗎啡組(n=10)與LPS+siRNAHSP60+嗎啡組(n=10)。對照組每天8:00注射生理鹽水10 μl；嗎啡組每天8:00鞘內(nèi)注射15 μg嗎啡(10 μl)；siRNA-NC+嗎啡組和siRNA-HSP60+嗎啡組分別給予含有10 μg siRNA-NC或siRNA-HSP60的DEPC溶液10 μl，然后注射15 μg嗎啡(10 μl)；LPS+siRNA-HSP60+嗎啡組在注射嗎啡前30 min給予10 μg siRNA-HSP60(10 μl)和10 μl LPS溶液，不同藥物間隔30 min，然后注射15 μg嗎啡(10 μl)。各組均連續(xù)處理7 d。

1.3 大鼠行為學測試 采用水浴甩尾法(hot-water tail flick test)測定大鼠甩尾潛伏期(tail flick latency，TFL)的變化，以評價嗎啡的鎮(zhèn)痛效果。各組分別在1、3、5和7 d給予嗎啡后30 min將鼠尾1.5～3.0 cm放入(52±0.5) ℃恒溫水浴中，用秒表記錄鼠尾自浸入水中到出現(xiàn)甩尾動作的時間，此時間間隔為甩尾反應(yīng)的TFL，為防大鼠組織發(fā)生損傷，如大鼠在10 s內(nèi)未出現(xiàn)甩尾，則TFL記為10 s。TFL用最大效應(yīng)百分數(shù)(MPE)表示：MPE(%)=(給藥后TFL－給藥前TFL)/(10－給藥前TFL)×100%。

1.4 脊髓組織制備及OX-42免疫熒光化學染色 給藥7 d后每組隨機抽取6只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深度麻醉并處死，左心室灌注預(yù)冷的生理鹽水100 ml和4%多聚甲醛400 ml固定。取L4～L6節(jié)段脊髓，4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水、二甲苯透明，石蠟浸潤包埋、切片，厚度5 μm，置于0.01 mol/L PBS溶液中。每只大鼠脊髓分別取5個連續(xù)切片備用。根據(jù)OX-42試劑盒說明書步驟進行免疫熒光染色。OX-42(1:300) 4 ℃孵育過夜，熒光素標記羊抗小鼠二抗(1:1000) 37 ℃避光孵育1 h，各步驟間用PBS洗滌3次，最后用50%甘油封片。采用Olympus數(shù)字顯微鏡系統(tǒng)(400倍鏡)觀察，隨機選取每張組織切片的3個視野進行數(shù)碼拍照，應(yīng)用Image pro-Plus 6.0軟件對OX-42陽性細胞進行計數(shù)分析。

1.5 RT-PCR法檢測脊髓組織中HSP60以及炎性因子IL-1β、TNF-α mRNA的表達 給藥7 d后各組其余4只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深度麻醉并處死，分離L4～L6節(jié)段脊髓組織，-80 ℃保存。提取總RNA，應(yīng)用Prime Script試劑盒的SYBR Green Assay完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用cDNA的第一鏈作為模板進行PCR擴增。使用ABI7500快速實時定量PCR系統(tǒng)，以GAPDH為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法分析待測基因的相對表達水平。目的基因引物序列由金斯瑞公司合成，具體如下：HSP60，上游5'-TTGATGTATGCTCTGTGGAAG-3'，下游5'-AGGCCTACGTATGAATGCGTATTGG-3'； IL-1β，上游5'-TCATTGTGGCTGTGGAGAAG-3'，下游5'-AGGCCACAGGTATTGTCG-3'；TNF-α，上游5'-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3'，下游5'-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3'；GAPDH，上游5'-AACGACCCCTTCATAC-3'，下游5'-TCCACGACATACTCAGCC-3'。

1.6 Western blotting檢測脊髓組織中HSP60、TLR4、p-p38MAPK和p38MAPK蛋白的表達水平 取剩余脊髓組織，按照KeyGEN全蛋白提取試劑盒步驟提取總蛋白，使用BCA定量試劑盒進行定量分析。上樣量25 μg/孔，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5% BSA的TBST液室溫封閉1 h，加入一抗HSP60(1:1000)、TLR4(1:1000)、p-p38M APK(1:1000)、p38M APK(1:1000)、β-actin(1:5000)孵育過夜，TBST洗膜3次，室溫條件下以辣根過氧化物酶標記特異性二抗(1:5000)孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光液于熒光和可見光凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)顯影并進行灰度分析，計算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，半定量分析目的蛋白的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠嗎啡耐受形成中伴隨著脊髓組織HSP60的異常表達 RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，嗎啡組大鼠脊髓組織中HSP60 mRNA和蛋白的表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。為了進一步研究HSP60參與嗎啡耐受形成的機制，連續(xù)7d鞘內(nèi)注射siRNA-HSP60，結(jié)果顯示，與siRNA-NC+嗎啡組比較，siRNA-HSP60+嗎啡組大鼠脊髓組織中HSP60 mRNA和蛋白的表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠脊髓組織中HSP60 mRNA和蛋白的表達量比較(n=4)Fig.1 Comparison of the levels of HSP60 mRNA and protein in spinal cord tissues of rats in each group (n=4)

2.2 抑制HSP60可明顯改善大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的形成 行為學測試結(jié)果顯示，注射嗎啡1、3、5和7 d后，與對照組相比，嗎啡組大鼠對疼痛的耐受度增加(P<0.05)；與注射嗎啡1、3 d后相比，嗎啡組大鼠在注射嗎啡5 d和7 d后疼痛耐受明顯減弱(P<0.05)，表明形成了嗎啡耐受。注射嗎啡5 d和7 d后，siRNA-HSP60+嗎啡組大鼠較siRNA-NC+嗎啡組大鼠對疼痛的耐受度明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

2.3 HSP60缺失抑制大鼠腰段脊髓背角小膠質(zhì)細胞的活化 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，嗎啡組大鼠脊髓組織中OX-42陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.05)；與siRNA-NC+嗎啡組相比，siRNAHSP60+嗎啡組大鼠脊髓組織中OX-42陽性細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖2 HSP60在大鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成中的作用(n=10)Fig.2 Inhibition of HSP60 significantly improves the formation of morphine antinociceptive tolerance (n=10)

2.4 鞘內(nèi)注射siRNA-HSP60抑制嗎啡耐受大鼠脊髓組織中炎性因子IL-1β和TNF-α的釋放 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，嗎啡組大鼠脊髓組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而siRNA-HSP60+嗎啡組大鼠脊髓組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達量均明顯少于siRNA-NC+嗎啡組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

2.5 下調(diào)H S P 6 0 通過抑制嗎啡耐受大鼠脊髓TLR4-p38 MAPK信號通路緩解大鼠嗎啡耐受 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，嗎啡組大鼠脊髓中TLR4和p-p38MAPK的表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與siRNANC+嗎啡組相比，siRNA-HSP60+嗎啡組大鼠脊髓中TLR4和p-p38MAPK的表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。表明下調(diào)HSP60可抑制TLR4-p38MAPK信號通路激活。

圖3 各組大鼠脊髓組織中OX-42陽性細胞數(shù)比較(n=6)Fig.3 Comparison of the number of positive OX-42 cells in the spinal cord of rats in each group (n=6)

圖4 各組大鼠脊髓組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達水平(n=4)Fig.4 Expression levels of IL-1β and TNF-α mRNA in spinal cord tissues of rats in each group (n=4)

2.6 激活TLR4-p38MAPK信號通路可拮抗HSP60缺失對嗎啡耐受的抑制作用 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與siRNA-HSP60+嗎啡組相比，LPS+siRNA-HSP60+嗎啡組大鼠脊髓組織中TLR4和p-p38MAPK的表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)；同時，行為學測試結(jié)果顯示，在5 d和7 d形成嗎啡耐受時，LPS+siRNA-HSP60+嗎啡組大鼠對疼痛的耐受度弱于siRNA-HSP60+嗎啡組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖6)。

3 討 論

應(yīng)激狀態(tài)下HSP往往表現(xiàn)為過度表達或異位表達，并且參與信號轉(zhuǎn)導的過程。其中HSP60參與多種臨床病理過程，如自身免疫性疾病、心肌炎、動脈粥樣硬化，以及移植排斥反應(yīng)等免疫相關(guān)的疾病[9-10]。本研究采用連續(xù)鞘內(nèi)注射嗎啡建立嗎啡鎮(zhèn)痛耐受模型，Western blotting檢測結(jié)果證實嗎啡組HSP60表達量明顯增加，沉默HSP60可顯著改善嗎啡耐受。

圖5 各組大鼠脊髓組織中TLR4-p38MAPK相關(guān)蛋白的表達情況(n=4)Fig.5 Expression of TLR4-p38MAPK related proteins in spinal cord tissue of rats in each group (n=4)

圖6 激活TLR4-p38MAPK信號通路逆轉(zhuǎn)HSP60缺失對嗎啡耐受的作用(n=10)Fig.6 Activation of TLR4-p38MAPK signaling pathway reverses the effect of HSP60 deficiency on morphine tolerance (n=10)

小膠質(zhì)細胞在嗎啡耐受中發(fā)揮重要作用，許多研究證實，嗎啡處理可促進OX-42的表達，并誘導膠質(zhì)源性促炎細胞因子的釋放[11]。白藜蘆醇可通過抑制小膠質(zhì)細胞的活化及炎性因子的產(chǎn)生，降低嗎啡耐受性[12]。文獻報道，HSP60缺失會減輕小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)[13]。OX-42是小膠質(zhì)細胞的特異性標志物，本研究結(jié)果顯示，嗎啡組大鼠OX-42陽性細胞數(shù)較對照組明顯增多，表明大鼠經(jīng)嗎啡處理后，小膠質(zhì)細胞顯著活化。沉默HSP60后OX-42陽性細胞數(shù)減少，表明抑制HSP60阻礙了嗎啡介導的小膠質(zhì)細胞活化。部分研究表明，在嗎啡注射模型或其他神經(jīng)性疼痛模型中，促炎因子IL-1β和TNF-α的表達水平顯著升高[14]；抑制炎性因子的產(chǎn)生能改善嗎啡耐受[3,15]。本研究結(jié)果顯示，沉默HSP60可抑制嗎啡介導的IL-1β和TNF-α表達，表明HSP60缺失可顯著抑制嗎啡介導的小膠質(zhì)細胞活化及炎癥反應(yīng)。

嗎啡能夠與機體TLR4上的髓樣分化因子2 (myeloid differentiation factor-2，MD-2)相結(jié)合，激活TLR4信號通路，活化小膠質(zhì)細胞，釋放炎性因子(包括TNF-α和IL-1β)，從而加重中樞敏化，降低機體對疼痛的耐受度[16-17]。有研究結(jié)果顯示，抑制TLR4可降低嗎啡耐受性[17]。若能找到一個分子或者藥物阻斷TLR4通路，有可能抑制嗎啡介導的小膠質(zhì)細胞活化及炎癥反應(yīng)，最終調(diào)控機體對疼痛的耐受。Swaroop等[18]研究發(fā)現(xiàn)，沉默HSP60可通過抑制TLR4-p38MAPK通路降低小膠質(zhì)細胞中TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和IL-6的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默HSP60可顯著抑制TLR4-p38MAPK信號通路的激活。為了進一步證實沉默HSP60是通過調(diào)控TLR4-p38MAPK信號通路而影響嗎啡耐受，本研究采用LPS激活TLR4信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活TLR4信號通路后，沉默HSP60對嗎啡耐受的作用被逆轉(zhuǎn)，證實TLR4-p38MAPK信號通路參與了HSP60調(diào)控嗎啡耐受的形成過程，提示激活TLR4受體能夠明顯逆轉(zhuǎn)脊髓HSP60缺失對大鼠嗎啡耐受的改善作用。

綜上所述，沉默HSP60可通過抑制小膠質(zhì)細胞活化和炎性因子的釋放而降低嗎啡耐受性，TLR4-p38MAPK信號通路參與了該過程，為HSP60應(yīng)用于嗎啡耐受的臨床防治提供了理論基礎(chǔ)。