基于液氮研磨法的流式細胞術(shù)檢測馬鈴薯倍性的研究

鄭英轉(zhuǎn) 呂燕 楊東旭 李國威 王洪洋 李燦輝

（1. 云南師范大學云南省馬鈴薯生物學重點實驗室，昆明 650500；2. 云南師范大學云南省高校馬鈴薯生物學重點實驗室，昆明 650500；3. 云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；4. 甘肅省禮縣三峪鄉(xiāng)九年制學校，隴南 742219）

流式細胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)C）是一種利用流式細胞儀（Flow cytometers）快速多參數(shù)分析流體中單個細胞（或其他任何微粒，如細胞核、微生物和染色體制劑等）的技術(shù)［1］。目前，流式細胞術(shù)廣泛應用于免疫學、分子生物學、細菌學、病毒學等領(lǐng)域。在植物學研究中，流式細胞術(shù)主要用于檢測植物細胞核DNA的含量以及染色體的倍性等方面［2-4］。根據(jù)細胞分裂的原理，在分裂過程中生物體中會同時存在含有2n和4n染色體數(shù)的細胞核，而染色體數(shù)目與DNA含量成正相關(guān)，所以測得細胞周期不同階段的DNA含量，就可以間接反映出所測細胞的染色體倍性水平［5-6］。一般而言，用流式細胞儀檢測得到的流式圖譜中，其橫軸都有2個峰，第一個峰表示含2n個染色體細胞核的熒光強度（即G0/G1期，M3峰），第二個峰表示加倍后的（即4n染色體）細胞核熒光強度（即G2/M期，M4峰）；其縱軸則表示檢測到的細胞數(shù)目。用流式細胞儀檢測DNA含量時首先必須要對DNA進行熒光染色，常用的核酸熒光染料有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、異硫氰基熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）等。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是全球解決糧食短缺和消除貧困的重要作物，分布較為廣泛，且染色體倍性豐富。在自然界中有二倍體（2n= 24）、三倍體（2n= 36）、四倍體（2n=48）、五倍體（2n=60）、六倍體（2n= 72）存在。這些不同倍性馬鈴薯資源具有抗病、抗蟲、耐極端環(huán)境等優(yōu)良性狀，是馬鈴薯育種工作中重要的種質(zhì)資源［7］。染色體倍性鑒定是馬鈴薯倍性育種及應用研究的重要環(huán)節(jié)。如何應用最簡便、有效且盡可能早期鑒定出植株的倍性水平，可以大大減少育種的工作量及盲目性，降低成本，加速育種進程，對馬鈴薯品種選育具有重要意義。

盡管馬鈴薯倍性鑒定方法有很多種［8］，但是利用流式細胞術(shù)法對其染色體倍性鑒定的應用研究仍然較少。本研究以流式細胞術(shù)為基礎(chǔ)，使用刀片切碎法和液氮研磨法制備馬鈴薯細胞核懸液，比較了這兩種樣品制備方法在測定倍性中的異同之處，并分析液氮研磨法制備的細胞核懸液在不同時間梯度的核酸熒光染料染色下對測定結(jié)果的影響，在此基礎(chǔ)上建立一套適用于馬鈴薯倍性鑒定的高效樣品制備方法，旨為后續(xù)大規(guī)模馬鈴薯倍性鑒定和推動馬鈴薯育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

云南師范大學馬鈴薯課題組前期以四倍體栽培種C88（S. tuberosumssp.andigena）為母本、雙單倍體誘導系二倍體IVP101（S. phurejia）為父本進行雜交，創(chuàng)建C88孤雌誘導后代群體。以20份C88孤雌誘導后代、C88及IVP101為樣品制備材料，將其種植在溫室中，待植株生長至2個月時，選取健康無病斑且大小適中的成熟葉片0.3-0.5 g（大約兩片葉子）進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 裂解液的配制 試驗過程中所用裂解液的配方如下（以配制1 L為例）：氯化鎂（MgCl2）9.148 g、檸檬酸鈉（C6H5O7Na3·2H2O）8.822 g、3-嗎啉丙磺酸（C7H15NO4S）4.186 g和Triton X-100（液體）1 mL。將以上試劑溶解于無菌雙蒸水中，并于4℃保存，配制過程中一定要使Triton X-100充分溶解。

1.2.2 刀片切碎法細胞核懸液的制備 （1）從溫室取適當葉片，裝入自封袋，編號（如果當天不能處理葉片，可放4℃保存過夜）。（2）取直徑6 cm的小培養(yǎng)皿分別按照所取材料編號，把葉片用無菌雙蒸水沖洗干凈，用濾紙擦干水，放入相應編號的培養(yǎng)皿中，加入4℃預冷的裂解液2 mL，用刀片快速將葉片切碎（此步驟每個樣品平均耗時大約7.5 min），然后放于冰上裂解至少30 min，使細胞核釋放出來。（3）吸取培養(yǎng)皿中裂解液，用400目的濾膜將其過濾至1.5 mL的離心管中，過濾后的離心管放冰上，直到所有的樣品過濾完。（4）于4℃離心機中1000-2000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀即是細胞核。（5）向沉淀中加入1 mL預冷的裂解液，加入熒光染料PI（1 mg/mL）50 μL，然后用震蕩儀重新懸浮沉淀，于冰盒中或者4℃黑暗避光染色。

1.2.3 液氮研磨法細胞核懸浮液的制備 （1）取材方法同1.2.2，從溫室取的葉片用無菌雙蒸水沖洗干凈，用濾紙擦干水分。（2）將清洗干凈的葉片放入研缽中，加入適量（5-10 mL）液氮迅速研磨成粉末（此步每個樣品平均耗時大約1.5 min），然后加入2 mL預冷的裂解液，再將其轉(zhuǎn)入5 mL離心管中插入冰上裂解30 min。（3）用400目濾膜將其過濾至1.5 mL離心管中，待所有樣品都過濾完后，于4℃離心機中1000-2000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀即是細胞核。（4）向沉淀中加入1 mL預冷的裂解液，加入熒光染料PI（1 mg/mL）50 μL，然后用震蕩儀重新懸浮沉淀，于冰盒中或者4℃黑暗避光染色。

1.2.4 熒光染料染色時間的設(shè)置 為了驗證刀片切碎法和液氮研磨法制備的細胞核懸液之間測定結(jié)果有無差異時，熒光染料染色時間設(shè)置為30 min；為了驗證液氮研磨法制備的細胞核懸液在不同染色時間梯度下的測定結(jié)果是否有差異時，設(shè)置的染色時間為15 min、30 min、60 min、6 h和12 h。

1.2.5 流式細胞術(shù)測定與數(shù)據(jù)分析 取20份C88孤雌誘導后代植株葉片，然后將從每一株植株上獲取的葉片平均分為2份，一份利用液氮研磨法制備細胞核懸液；另一份用刀片切碎法制備細胞核懸液，然后進行染色（用PI染料染30 min）和上機測定。所用流式細胞儀品牌為ACEA NovoCyte，測定步驟按照儀器操作說明進行，數(shù)據(jù)處理軟件為NovoExpress 1.3.0。最終得到的流式峰值圖中，橫坐標為細胞核DNA相對含量的熒光強度，縱坐標為細胞核數(shù)量；流式散點圖中，橫坐標為細胞的總熒光強度，縱坐標為顆粒度。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析用SPSS 20.0軟件完成，P＜0.05時認為存在統(tǒng)計學意義上的顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同方法制備細胞核懸液的效果比較

圖1 不同制備方法獲得的細胞核懸液中細胞核所占的比例

2.1.1 細胞核懸液中細胞核的比例 對20份C88孤雌誘導后代植株葉片分別進行液氮研磨法和刀片切碎法制備樣品，經(jīng)流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)均可產(chǎn)生非常明顯的散點圖（圖1-A和圖1-B）。它們都在橫坐標為105.6和105.8處即分別展示出細胞核顯著聚集在一起的現(xiàn)象，并且具有不同熒光強度的2個細胞核群可以完全分開，說明這兩種制備方法都能收集到的完整細胞核。但是，利用液氮研磨法制備的樣品中，除了明顯被熒光染料染色的細胞核之外，還伴隨大量其他顆粒成分存在，導致圖中顯示的細胞核聚集程度不是十分緊密（圖1-A），而在刀片切碎法的結(jié)果中，其他顆粒成分則較少，細胞核聚集程度較為緊密（圖1-B）。此外，液氮研磨法制備的細胞核懸液中，細胞核的占比約為34.73%，而在刀片切碎法制備的懸液中，細胞核的占比約為61.63%（圖1-C）。以上結(jié)果說明，雖然液氮研磨法得到細胞核的數(shù)量比刀片切碎法得到的少，但這兩種方法制備的細胞核懸液并不會導致細胞核的染色結(jié)果有差異。

2.1.2 熒光強度的比較 將上述2種樣品制備方法得到的細胞核懸液經(jīng)過流式細胞儀檢測后，發(fā)現(xiàn)無論是液氮研磨還是刀片切碎，其結(jié)果都能得到明顯的峰圖（圖2）。其中，第一個峰為含2n個染色體細胞核的熒光強度，也就是表示處于G0/G1期的細胞核DNA含量（圖中標為M3），第二個峰為含4n個染色體細胞核熒光強度，即表示處于G2/M期的細胞核DNA含量（圖中標為M4）。從圖2-A和圖2-B可以直觀地看出，在橫坐標上，液氮研磨產(chǎn)生的M3、M4峰和刀片切碎產(chǎn)生的M3、M4峰基本位于坐標軸相同的位置。同時，將用這兩種不同方法得到的M3和M4峰值數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同方法得到的M3和M4的數(shù)值之間并無統(tǒng)計學上的差異性（圖2-C和圖2-D）。另外，用M4的數(shù)據(jù)除以M3的數(shù)據(jù)得到的比值在液氮研磨和刀片切碎中各自均接近2，并且互相之間也無統(tǒng)計學上的差異（圖2-E），這也符合細胞分裂時DNA含量變化的基本規(guī)律。結(jié)果表明，在利用流式細胞儀測定馬鈴薯倍性時，液氮研磨法制備細胞核懸液和刀片切碎法制備細胞核懸液所得的結(jié)果是一致的，這兩種方法都是可行的。

圖2 不同制備方法獲得的細胞核懸液中細胞核DNA含量的直方圖

2.2 液氮研磨法中不同染色時間的效果比較

在細胞核懸液的熒光染料染色時間方面，前人的報道［9］和文中所用均為30 min，當這一時間縮短或者延長時是否會對倍性鑒定結(jié)果造成影響呢？我們就這一問題繼續(xù)開展了探究。以20株C88孤雌誘導后代植株為研究材料，用液氮研磨法制備細胞核懸液，然后進行PI染料染色，但在染色時間上，設(shè)置15 min、30 min、60 min、6 h和12 h等不同的時間梯度，每一時間點染色結(jié)束后立即進行流式細胞儀檢測，最終將所有結(jié)果匯總分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個染色時間梯度的M3和M4峰在縱坐標軸上的各自位置基本是一致的（圖3-A-E），并且在不同時間梯度上M3和M4峰值之間也沒有顯著差異（圖3-F）。結(jié)果說明，使用液氮研磨法制備的細胞核懸液按上述任一時間點進行染色時其倍性鑒定結(jié)果是一致的。

2.3 利用已知倍性馬鈴薯材料檢驗液氮研磨法的可靠性

為了進一步確定液氮研磨法制備的細胞核懸液在測定馬鈴薯倍性應用中的可靠性，選取已知四倍體馬鈴薯C88和二倍體馬鈴薯IVP101為材料，試驗過程中設(shè)置染色時間為30 min。在得到的直方圖中（圖4），四倍體馬鈴薯C88的M3峰的熒光強度為（572812±23210）（n=15），M4峰的熒光強度為（1108477±45678）（n=15）；二倍體馬鈴薯IVP101的M3峰的熒光強度為（300356±32502）（n=10），M4峰的熒光強度為（576561±58139（n=10）。四倍體馬鈴薯C88的M3和M4峰的熒光強度分別是二倍體馬鈴薯IVP101的M3和M4峰熒光強度的1.9倍和1.9倍，均接近2倍，符合4倍體和2倍體理論比值。該結(jié)果進一步證實了基于液氮研磨法的流式細胞術(shù)測定馬鈴薯染色體倍性的可靠性。

圖3 液氮研磨法中不同染色時間對馬鈴薯倍性測定結(jié)果的影響

3 討論

相對于其他鑒定染色體倍性的方法而言，流式細胞儀能夠快速地進行物種染色體倍性檢測，并且鑒定的結(jié)果真實可靠，已經(jīng)廣泛應用在動植物染色體倍性鑒定方面。在利用流式細胞術(shù)鑒定染色體倍性的試驗中，如何快速獲取足夠完整的細胞核是關(guān)鍵。目前，在植物倍性檢測時大多用刀片切碎法來制備細胞核懸液，如葡萄［10］、香蕉［11］、荔枝［12］、西瓜［13］、梨［14］、獼猴桃［15］、蒙古冰草［16］和槭樹［17］等。雖說該方法能夠得到較高完整樣品細胞核，但是同時也存在費時、費工等缺陷，不適于大批量樣品進行流式細胞術(shù)分析。本研究中，選取馬鈴薯C88孤雌誘導后代群體中的20個植株做重復試驗，在制備馬鈴薯葉片細胞核懸液時首次使用了液氮研磨法，并將這種方法和刀片切碎法進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)液氮研磨葉片簡便快速，磨碎單個樣品的平均耗時約為1.5 min，相比之下，刀片切碎單個樣品的平均耗時約為7.5 min。同時對液氮研磨法制備的細胞核懸液的純度和細胞核所占比例進行了分析，發(fā)現(xiàn)該法制備的細胞核懸液中雜質(zhì)稍多于刀片切碎法，但是在熒光染料染色30 min的情況下，具有不同熒光強度的2個細胞核群可以完全分開。另外，將液氮研磨法和刀片切碎法得到的直方圖進行了比較，結(jié)果也顯示用刀片切碎法得到的直方圖峰型細直、2個峰之間的黏連體少，而液氮研磨法得到的峰型總體基部偏大、2個峰之間黏連體偏多，但是通過對比測得的熒光強度（即DNA的含量）以及其比值發(fā)現(xiàn)，這兩種方法之間并沒有顯著的差異，說明液氮研磨法并不會影響倍性的檢測結(jié)果。

前人報道馬鈴薯倍性檢測時使用的熒光染料染色時間只有30 min一個時間點［9］，為了探索不同染色時間階段對馬鈴薯倍性檢測的影響，在應用液氮研磨法制備樣品的基礎(chǔ)上設(shè)置不同的染色時間梯度，發(fā)現(xiàn)15 min、30 min、60 min、6 h和12 h等不同的時間梯度下，倍性測定結(jié)果之間并無統(tǒng)計學上的顯著差異，說明這些時間點均可用于測定倍性過程中的染色步驟。另外，應用液氮研磨法對已知倍性的四倍體馬鈴薯C88和二倍體馬鈴薯IVP101進行鑒定，結(jié)果符合預期，進一步說明基于液氮研磨法的流式細胞術(shù)可用于馬鈴薯倍性分析。

圖4 使用液氮研磨法檢測已知四倍體和二倍體馬鈴薯細胞核DNA含量的直方圖

4 結(jié)論

利用流式細胞術(shù)對馬鈴薯倍性進行鑒定時，使用液氮研磨法的細胞核懸液染色15 min就能滿足倍性鑒定的需要，大大縮短了制備樣品時間?；谝旱心シㄖ苽浼毎藨乙壕哂泻唵?、快速的特點，克服了傳統(tǒng)刀片切碎法帶來的操作難度較大、耗時長的不足。該方法適合于大量馬鈴薯樣本的染色體倍性鑒定分析。