單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)分析方法研究進(jìn)展

張淼 孫祥瑞 徐春明

（北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100048）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域，因其具有通量高、速度快、靈敏度高等優(yōu)勢，可在短時(shí)間內(nèi)檢測大量樣本的基因變異及轉(zhuǎn)錄水平，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。以二代測序（Next generation sequencing，NGS）為典型代表的高通量測序已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷、治療及預(yù)后評估［1］。

NGS可分為DNA測序和RNA測序，DNA測序以檢測基因變異為主［2］，如堿基替換、小片段插入及缺失等，RNA測序主要以檢測基因的mRNA豐度為主［3］。根據(jù)所測細(xì)胞的群體區(qū)分，RNA測序可分為全轉(zhuǎn)錄組測序（Bulk RNA sequencing，bulk RNA-Seq）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（Single cell RNA sequencing，scRNA-Seq）。Bulk RNA-Seq是目前最常用的RNA測序方法，但由于測序樣本普遍具有異質(zhì)性，bulk RNA-Seq結(jié)果僅能代表大細(xì)胞群體中每一個(gè)基因的平均表達(dá)水平，對比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究有幫助，但不利于異質(zhì)性研究。2009年scRNA-Seq技術(shù)［4］被首次引用，測序樣本異質(zhì)性問題得到一定程度解決，并逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。scRNA-Seq原理是分離單個(gè)細(xì)胞并提取RNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序，主要工作流程包括細(xì)胞解離、單細(xì)胞分離、文庫構(gòu)建、上機(jī)測序及數(shù)據(jù)分析［3］，其中數(shù)據(jù)分析是整個(gè)scRNA-Seq過程中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

由于scRNA-Seq所使用的數(shù)據(jù)分析方法有別于bulk RNA-Seq，越來越多的針對scRNA-Seq技術(shù)的數(shù)據(jù)分析方法不斷涌現(xiàn)，但每種分析方法都有各自的優(yōu)勢及局限性。因此，本文對比了scRNA-Seq與bulk RNA-Seq技術(shù)在數(shù)據(jù)分析上的差異，對scRNASeq數(shù)據(jù)分析研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，探討每種方法的優(yōu)勢與局限性，以期能夠?qū)cRNA-Seq數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行系統(tǒng)了解。

1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

1.1 數(shù)據(jù)的比對

在scRNA-Seq過程中，測序數(shù)據(jù)下機(jī)后需要進(jìn)行預(yù)處理，將基因轉(zhuǎn)錄序列轉(zhuǎn)換為fastq格式并與參考序列比對，鑒定差異表達(dá)基因或?qū)ふ铱勺兗羟形稽c(diǎn)。scRNA-Seq數(shù)據(jù)整體質(zhì)量評估的重要指標(biāo)是比對率，即reads在參考基因組中所占的比例。比對率越高說明數(shù)據(jù)利用率越高［5］。目前應(yīng)用于數(shù)據(jù)比對的工具主要有TopHat［6］，STAR［7］或HISAT［8］。TopHat工具以Bowtie作為核心算法針對75 bp以上長度的RNA短序列與參考基因組進(jìn)行比對，找到匹配的序列，對外顯子進(jìn)行選擇性拼接，具有內(nèi)存小、準(zhǔn)確性高、容錯(cuò)率低、可跨內(nèi)含子比對等優(yōu)勢。Donbin等［7］研究發(fā)現(xiàn)STAR工具的核心算法是Maximal mappable prefix（MMP），其直接選用非連續(xù)序列進(jìn)行比對，運(yùn)行速度較TopHat工具快，但需要更大的內(nèi)存。HISAT工具基于Burrows-Wheeler變換（BWT）和Ferragina-Manzini索引（FM）結(jié)合的算法進(jìn)行對齊。Kim等［8］研究發(fā)現(xiàn)HISAT是第一個(gè)采用分層索引以及自適應(yīng)策略進(jìn)行對齊的工具，減少了內(nèi)存需求，也是目前運(yùn)行速度最快的工具，具有同其他比對工具相同甚至更高的精度。從總體來看，以上3種軟件在運(yùn)行速度和結(jié)果準(zhǔn)確性方面均表現(xiàn)良好，但Engstr?m等［9］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)行速度較快的軟件通常檢測的準(zhǔn)確性較低。

1.2 質(zhì)量控制

數(shù)據(jù)識別和去除低質(zhì)量細(xì)胞是scRNA-Seq質(zhì)量控制（Quality control，QC）的關(guān)鍵步驟。首先，在細(xì)胞捕獲過程中應(yīng)避免參雜混合或死亡的細(xì)胞。其次，使用FastQC［10］等工具檢查測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，根據(jù)QC值決定其在后續(xù)分析中是否被舍棄。異常的cut-off值可以人為定義，也可由程序自動(dòng)定義，但需考慮被分析組織的多樣性。此外，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞質(zhì)RNA會(huì)丟失，但線粒體RNA會(huì)保留在受損細(xì)胞中，線粒體RNA含量是QC的另一個(gè)指標(biāo)［11］。除上述方法外，Jiang等［12］最新提出的一種針對單細(xì)胞RNA序列質(zhì)量控制（SinQC）工具，通過整合基因表達(dá)模式和數(shù)據(jù)質(zhì)量信息來檢測并去除低質(zhì)量細(xì)胞。

1.3 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化是數(shù)據(jù)預(yù)處理的關(guān)鍵步驟。在bulk RNA-Seq中，DESeq2［13］和TMM［14］是常用的標(biāo)準(zhǔn)化處理算法。然而，DEseq2算法并不適用于scRNA-Seq數(shù)據(jù)分析，因?yàn)镈Eseq2算法假設(shè)所有樣本RNA總量相等，reads數(shù)僅與測序深度有關(guān)，根據(jù)不同樣本的reads數(shù)來計(jì)算比例，但對于單個(gè)細(xì)胞可能會(huì)受到零值和高變異性的影響，結(jié)果不穩(wěn)定。因此，Bacher等［15］提出SCnorm工具，其使用分位數(shù)回歸的方法對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，可以避免針對bulk RNA-Seq的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化方法對scRNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)所引入的錯(cuò)誤，改善主成分分析和差異表達(dá)基因的識別，可以用于scRNA-Seq數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。最常用的數(shù)據(jù)歸一化方法為 Count depth scaling，又稱為Counts per million（CPM），它會(huì)根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的總表達(dá)量計(jì)算一個(gè)size factor，然后對其中各個(gè)基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。除CPM外，非線性標(biāo)準(zhǔn)化方法使用測序深度擬合的負(fù)二項(xiàng)模型，可解釋更復(fù)雜的異質(zhì)性。因此，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法的使用需要根據(jù)不同細(xì)胞特性進(jìn)行選擇，單一的標(biāo)準(zhǔn)化方法不能適用于所有類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)。

2 插補(bǔ)

在測序過程中，很多低表達(dá)或中度表達(dá)的基因無法有效檢測到，導(dǎo)致表達(dá)值為零或減少，影響下游后續(xù)分析，增加細(xì)胞間變異，甚至不能獲得完整的單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息，這種情況稱之為Dropout。在實(shí)際操作過程中Dropouts［16］對數(shù)據(jù)分析影響較大，合適的插補(bǔ)方法可以彌補(bǔ)Dropout產(chǎn)生的影響。目前針對插補(bǔ)開發(fā)的算法有MAGIC［17］、ScImpute［18］、SAVER［19］、DrImpute［20］和AutoImpute［21］，各種算法的計(jì)算原理不同。MAGIC算法使用基于Markov親和力的矩陣確定細(xì)胞間的相似性，對高度相似細(xì)胞中基因表達(dá)進(jìn)行聚集，以估算基因表達(dá)量。ScImpute算法通過擬合Gamma-Normal混合模型估算基因缺失概率，根據(jù)相似細(xì)胞信息估算可能的Dropout。SAVER和MAGIC算法分析可能會(huì)造成未受Dropout影響的基因表達(dá)發(fā)生變化，但ScImpute算法可以利用其他類似細(xì)胞中不太可能受Dropout影響的相同基因信息，在不引入新偏差情況下計(jì)算缺失值。有研究表明，MAGIC和scImpute算法都依賴于相似細(xì)胞基因數(shù)據(jù)，這會(huì)消除細(xì)胞間的隨機(jī)性，而Huang等［19］提出的SAVER算法來接收具有唯一分子索引的矩陣后，假定每個(gè)基因都遵循Poisson-Gamma模型，使用多元廣義泊松回歸模型的貝葉斯分析還原基因表達(dá)水平，消除技術(shù)差異的同時(shí)還可保留不同細(xì)胞間的生物學(xué)差異。DrImpute是一種集群分析算法，通過使用Spearman和Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算距離矩陣，可將Dropout從真正的零值中有效地分離出來。Gong等［20］將DrImpute算法與多種插補(bǔ)算法進(jìn)行性能比較發(fā)現(xiàn)，與MAGIC和scImpute算法相比，DrImpute可以恢復(fù)更多的缺失值，提高后續(xù)細(xì)胞類型識別和擬時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性。受到上述軟件的啟發(fā)，Talwar等［21］提出了AutoImpute自編碼分析算法，通過學(xué)習(xí)scRNA-Seq數(shù)據(jù)的固有分布和模式來尋找缺失值。通過與現(xiàn)有的9種獨(dú)立數(shù)據(jù)集的插補(bǔ)算法進(jìn)行比較，AutoImpute被證實(shí)是唯一能對最大數(shù)據(jù)集進(jìn)行插補(bǔ)而不會(huì)消耗內(nèi)存的算法。

3 批次效應(yīng)校正

完整的RNA測序流程包括細(xì)胞分離、RNA提取、文庫構(gòu)建、上機(jī)測序及測序后數(shù)據(jù)分析等多個(gè)環(huán)節(jié)，但不同實(shí)驗(yàn)室、不同時(shí)間以及不同人員操作會(huì)造成批次效應(yīng)，影響結(jié)果可靠性。批次效應(yīng)也成為scRNA-Seq技術(shù)中常見的變異來源［22］。由于scRNASeq與bulk RNA-Seq在數(shù)據(jù)特征上具有差異，常規(guī)用于 bulk RNA-Seq的批次校正算法，如RUVseq［23］和svaseq［24］等算法可能并不適用于scRNA-Seq。但是，在scRNA-seq研究中，批次之間的種群組成通常并不相同，即使假設(shè)每個(gè)批次中存在相同的細(xì)胞類型，數(shù)據(jù)集中每種細(xì)胞類型的豐度也會(huì)根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)或組織提取、解離等過程中的細(xì)微差異而變化，因此造成變異的因子并非僅考慮技術(shù)性因素。為了校正單細(xì)胞測序中的批次效應(yīng)，多種scRNASeq數(shù)據(jù)校正算法被開發(fā)，包括ComBat［25］、相互最 近 鄰（Mutual nearest neighbours，MNN）［26］和Scanorama［27］等。當(dāng)批次信息可用時(shí)，ComBat算法使用參數(shù)和非參數(shù)經(jīng)驗(yàn)貝葉斯框架通過批處理效應(yīng)變量的加法組合來描述基因表達(dá)。Haghverdi等［26］提出的MNN算法是計(jì)算成對細(xì)胞的余弦歸一化表達(dá)譜之間的歐氏距離，再根據(jù)每個(gè)批次中共享種群的偏差來調(diào)整批次效果。盡管MNN和ComBat是常用的分析算法，但研究發(fā)現(xiàn)MNN算法性能要優(yōu)于ComBat。Hie等［27］最近提出的Scanorama是采用一種可識別并準(zhǔn)確整合數(shù)據(jù)集合的算法，利用匹配的信息進(jìn)行批次效應(yīng)校正，相比于MNN算法，該技術(shù)不需要依賴于數(shù)據(jù)集的順序，將鄰近搜索優(yōu)化為低維嵌入的基因表達(dá)譜，極大減少了搜索時(shí)間。

4 降維分析

高維性是scRNA-Seq數(shù)據(jù)的顯著特點(diǎn)，數(shù)據(jù)分析時(shí)常常要用到降維分析法。主成分分析（Principal component analysis，PCA）作為一種經(jīng)典的無監(jiān)督降維算法，借助正交變換使線性維數(shù)減少，產(chǎn)生一組不相關(guān)的分量，通過最大化投影數(shù)據(jù)的方差，將高維數(shù)據(jù)投影到低維線性空間上。其具有兩大主要優(yōu)勢：第一，PCA通過正交線性投影可以消除基因間的冗余，被用作多種降維方法的預(yù)處理步驟。第二，PCA可將高維數(shù)據(jù)投影到低維線性空間上，可以預(yù)測多維數(shù)據(jù)的相關(guān)性。研究表明［28］通過分散表達(dá)水平來過濾基因，然后選擇數(shù)百個(gè)最具可變性的基因來捕獲整個(gè)種群的重要特征。PCA已成功應(yīng)用于scRNA-Seq數(shù)據(jù)分析中［29-31］，以捕獲細(xì)胞異質(zhì)性的整體結(jié)構(gòu)，其局限性在于無法可視化細(xì)胞聚類和細(xì)胞類型識別所必須的局部結(jié)構(gòu)。

為了彌補(bǔ)PCA無法可視化的局限性，t分布隨機(jī)領(lǐng)域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）算法被引入單細(xì)胞測序分析。Alexander等［32］提出的t-SNE是一種用于高維數(shù)據(jù)可視化的非線性分析算法，通過捕獲局部結(jié)構(gòu)，將原始高維空間中不相似單元以大距離建模，而相似單元?jiǎng)t以小距離建模，在不丟失數(shù)據(jù)點(diǎn)間相對距離的基礎(chǔ)上，將高維數(shù)據(jù)嵌入到二維或三維空間中進(jìn)行可視化。通過降維與最近鄰網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合來考慮數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的局部距離，目的是分離不同的群集。t-SNE可以通過構(gòu)造概率分布來描述數(shù)據(jù)集，相似的單元格分配概率高，相異的單元格分配概率低，在高維空間中相似的單元將在低維空間中聚集在一起。t-SNE在維持相似細(xì)胞群集能力方面優(yōu)于PCA。目前，t-SNE還不能很好地捕獲全局結(jié)構(gòu)，如群集之間的距離。盡管t-SNE在scRNA-Seq數(shù)據(jù)可視化方面取得了成功，但仍存在兩種算法的缺陷［33］。首先，由于t-SNE的隨機(jī)性，同一數(shù)據(jù)集在不同的運(yùn)行中可能產(chǎn)生不同的可視化效果。為了獲得對種群結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，可能需要對同一數(shù)據(jù)集進(jìn)行多次t-SNE運(yùn)行。其次，雖然t-SNE將原始空間中相似單元格放置在低維空間中來維持簇，但原始空間中不相似單元格不一定會(huì)在低維空間中按比例放置。最近，一種基于黎曼幾何和代數(shù)拓?fù)淅碚摰腢MAP工具［34］被開發(fā)出來，其性能和效率均優(yōu)于t-SNE。UMAP工具能夠沿著分化軌跡排列簇并保留瞬時(shí)細(xì)胞的分化連續(xù)體，通過在二維或三維圖上覆蓋標(biāo)記基因的表達(dá)或與生物過程有關(guān)的一組基因的活性，捕獲scRNASeq數(shù)據(jù)中局部和全局結(jié)構(gòu)。

5 細(xì)胞亞型鑒定

在特定條件下，對組織中的細(xì)胞亞群進(jìn)行鑒定是scRNA-Seq數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵目標(biāo)之一，其結(jié)果可以揭示細(xì)胞異質(zhì)性［35］。結(jié)合降維分析方法，通過聚類分析實(shí)現(xiàn)細(xì)胞亞群的鑒定。在無監(jiān)督聚類分析中，主要以分層聚類和K-means聚類為主。分層聚類無需預(yù)先定義聚類數(shù)量，以聚集或分裂的方式進(jìn)行連續(xù)合并或拆分，目前常用的工具包括SINCERA［36］和bigSCale［37］。其中，Iacono等［37］提出的bigSCale工具框架構(gòu)建了一個(gè)概率模型來定義所有可變性成對細(xì)胞之間的表型距離。與在簡單或混合概率模型中假設(shè)負(fù)二項(xiàng)式，伽馬或泊松分布的其他方法相比，bigSCale工具構(gòu)建了一個(gè)高精度、全面的噪聲數(shù)值模型，通過將P值分配給每個(gè)基因來量化細(xì)胞間距離。而K-means聚類［11］則是先確定簇中心，再將細(xì)胞分配到最近的簇中心，迭代優(yōu)化質(zhì)心位置，將細(xì)胞分為 k個(gè)簇，根據(jù)質(zhì)心聚類中細(xì)胞的平均值重新計(jì)算質(zhì)心，工作速度快于分層聚類。以上兩種傳統(tǒng)聚類方法都會(huì)受到數(shù)據(jù)規(guī)模和噪聲的影響。為此，Lin等［38］在聚類前通過插補(bǔ)和降維進(jìn)行聚類（CIDR）使用非線性最小二乘回歸擬合數(shù)據(jù)，并對零值進(jìn)行插補(bǔ)來減弱Dropout影響。該算法可識別并評估Dropout與基因表達(dá)水平之間的關(guān)系，計(jì)算基因表達(dá)譜之間的差異。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)CIDR運(yùn)算速度遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)算法。近年來，新的聚類算法不斷被開發(fā)，如graph-based 聚類包括SNN［39］和RaceID2［40］，這些算法將單元格嵌入圖形中，每個(gè)邊代表兩個(gè)單元格之間的相似度，將圖形劃分為高度互連的模塊，具有高效性和穩(wěn)定性。Seurat基于共享近鄰（Shared nearest neighbor，SNN）聚類算法來識別細(xì)胞簇，通過差異表達(dá)或方差分析來識別不同亞群標(biāo)記物，基于表達(dá)水平的相似度的不同構(gòu)建共享近鄰網(wǎng)絡(luò)。為了證明SNN算法的有效性，Xu等［39］通過在不同結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)集上進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)，與原始數(shù)據(jù)的研究結(jié)論相同。為開發(fā)出一種可靠的方式推斷分化軌跡，Grün等［40］提出RaceID2工具，該軟件適合測試微分動(dòng)力學(xué)，在增加集群數(shù)后可通過識別集群內(nèi)的飽和點(diǎn)確定亞群數(shù)量，使數(shù)據(jù)比K-means聚類更可靠，且已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。除上述方法外，單細(xì)胞一致性聚類（Single cell consensus clustering，SC3）是特別為scRNA-Seq數(shù)據(jù)開發(fā)的聚類算法，通過共識方法將多個(gè)聚類算法組合在一起，具有高度的準(zhǔn)確性和魯棒性［41］，相比于K-means，SNN和SINCERA算法分析，SC3缺點(diǎn)是運(yùn)行時(shí)間長，但準(zhǔn)確性最高［42］。

6 差異表達(dá)分析

差異表達(dá)基因分析可以檢測不同細(xì)胞類型、不同細(xì)胞亞群間的mRNA豐度，通過組間比對，獲得不同樣本或不同處理方法對基因表達(dá)水平的影響，或上調(diào)或下調(diào)［43］，進(jìn)而可對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，如通過基因本體分析（Gene ontology，GO），確定基因所參與的生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞組分，通過KEGG分析差異基因參與的信號通路。盡管scRNA-Seq結(jié)果可以鑒定差異表達(dá)基因，但其也存在一定的局限性。首先，由于單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)通常具較高的背景噪音，很多低表達(dá)或者中等表達(dá)水平的基因不能被有效檢測到。所以，針對bulk RNASeq數(shù)據(jù)開發(fā)的差異表達(dá)檢測算法，并不完全適用于scRNA-Seq。針對scRNA-Seq的差異表達(dá)算法被陸 續(xù) 開 發(fā)，如SCDE［44］，MAST［45］，Census［46］和BCseq［47］等。其中，SCDE是一種運(yùn)用貝葉斯算法，從單個(gè)測量中獲得的不確定信息，使用泊松過程來解釋Dropouts，通過對比分析證明SCDE算法具有比傳統(tǒng)方法更高的靈敏度［44］。MAST算法采用線性模型對轉(zhuǎn)錄陽性表達(dá)的平均值進(jìn)行建模，同時(shí)控制模型的離散性和技術(shù)因素。其采用廣義相加模型（Generalized additive models，GAMS）與Tobit模型進(jìn)行正態(tài)分布。Finak等［45］通過比較發(fā)現(xiàn)SCDE算法檢測的差異表達(dá)基因數(shù)量高于MAST，但MAST算法的特異性更高。Qiu等［46］研究發(fā)現(xiàn)Census算法可將常規(guī)的相對表達(dá)量轉(zhuǎn)換為相對轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)的讀取計(jì)數(shù)相比，使用回歸技術(shù)更容易建模，而且顯著提高準(zhǔn)確度。BCseq算法無需指定偏差的來源或格式即可校正表達(dá)量化中的偏差，即以自適應(yīng)的方式糾正固有偏差，有效降低技術(shù)噪音。Chen等［47］通過對比發(fā)現(xiàn)BCseq算法在細(xì)胞類型分類性能上優(yōu)于MAST和SCDE。盡管多種算法被用于差異表達(dá)基因分析，但不同算法處理后的數(shù)據(jù)結(jié)果仍存在一定偏差。早期一項(xiàng)針對36種基因差異表達(dá)分析算法有效性的研究發(fā)現(xiàn)，不同算法得到的差異表達(dá)基因在特征及數(shù)量上均存在顯著差異［48］。因此，測序后數(shù)據(jù)分析算法的優(yōu)化仍然是今后的一項(xiàng)重要工作。

7 擬時(shí)序分析

擬時(shí)序分析法是指根據(jù)單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)模式推斷出細(xì)胞發(fā)育或分化的動(dòng)態(tài)路徑［49］。與bulk RNA-Seq不同，單細(xì)胞測序可以沿著一個(gè)連續(xù)發(fā)展的過程對細(xì)胞進(jìn)行排序，在軌跡的開始、中間和結(jié)束狀態(tài)對細(xì)胞類型進(jìn)行識別，進(jìn)展越少越接近原始細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)展越多越接近終點(diǎn)細(xì)胞狀態(tài)。針對scRNA-Seq擬時(shí)序分析開發(fā)的算法有Monocle［50］，Waterfall［51］，TSCAN［52］，Sincell［53］，SLICER［54］和Wishbone［55］。Monocle算法將無監(jiān)督的數(shù)據(jù)與反向圖形嵌入結(jié)合在一起，通過分化進(jìn)程對細(xì)胞進(jìn)行排序，揭示關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)中的變化及細(xì)胞分化的新型調(diào)控因子。Pere?íni 等［50］將Monocle算法可應(yīng)用于骨骼肌分化過程中，明確了一系列形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)。該算法將每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜表示為高維空間的一個(gè)點(diǎn)，高度相似的單元格之間添加連接邊，構(gòu)建最小生成樹圖，找到最長路徑的對應(yīng)轉(zhuǎn)錄序列，即可找到分化過程中單個(gè)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)路徑。當(dāng)對體內(nèi)連續(xù)生物學(xué)過程進(jìn)行scRNA-Seq分析時(shí)，由于缺少足夠的信息不適合使用Monocle等傳統(tǒng)方法，因此Jaehoon等［51］開發(fā)了一種更為通用的算法Waterfall，它可以對連續(xù)生物學(xué)過程的多位單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行無偏差統(tǒng)計(jì)分析，該算法使用Hidden markov模型以無偏差方式確定擬時(shí)序上每個(gè)基因的表達(dá)狀態(tài)，并量化為隨時(shí)間變化的分子級聯(lián)圖，最后將基因表達(dá)水平與擬時(shí)序相關(guān)聯(lián)。盡管Waterfall算法中曾考慮過細(xì)胞聚類的影響，但并未對細(xì)胞聚類對細(xì)胞有序性影響進(jìn)行系統(tǒng)評估，在此基礎(chǔ)上，Ji等［52］提出TSCAN工具，基于構(gòu)建最小生成樹之前對細(xì)胞進(jìn)行聚類可以降低復(fù)雜性，解決Monocle由于高復(fù)雜性造成的穩(wěn)定性差。Juliá 等［53］開發(fā)的Sincell實(shí)現(xiàn)了兩種算法，以區(qū)分穩(wěn)定細(xì)胞和噪聲影響的層次結(jié)構(gòu)，第一種依賴于基因重采樣程序；第二種系統(tǒng)隨機(jī)生成的復(fù)制細(xì)胞，這些復(fù)制細(xì)胞遵循原始細(xì)胞的隨機(jī)模式。Sincell可以提供細(xì)胞狀態(tài)層次結(jié)構(gòu)，同時(shí)考慮scRNA-Seq序列中的隨機(jī)因素。上述方法無法推斷對于非線性基因表達(dá)的變化和與過程無關(guān)的基因的分析，Welch等［54］開發(fā)SLICER使用局部線性嵌入來重建細(xì)胞軌跡，該算法可以推斷非線性的軌跡，無需了解過程即可選擇基因，并自動(dòng)確定分支的位置和數(shù)量，通過對小鼠非細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的驗(yàn)證，證實(shí)了此算法的有效性。如果要為多細(xì)胞構(gòu)建分支軌跡，上述方法在分辨率和準(zhǔn)確性上較為不足，Manu等［55］提出的Wishbone算法解決了此類問題，關(guān)鍵技術(shù)在于通過重復(fù)采樣邊緣子集來確定軌跡，并用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了Wishbone的準(zhǔn)確性。因此，選擇合適的方法應(yīng)主要依賴于數(shù)據(jù)集特點(diǎn)。

8 結(jié)語

隨著多種單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析方法的開發(fā)與應(yīng)用，在一定程度上促進(jìn)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，改善了高背景噪音和高變異性對數(shù)據(jù)產(chǎn)生的影響，為細(xì)胞異質(zhì)性研究奠定了分子基礎(chǔ)。但單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析仍面臨著新的問題和挑戰(zhàn)。首先，隨著單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集激增，如何提高軟件運(yùn)行速度和儲(chǔ)存效率是目前需要解決的一項(xiàng)重要問題。其次，由于不同實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)處理流程方面存在差異，結(jié)果的室間比對較為困難。因此，我們?nèi)匀挥斜匾獙ΜF(xiàn)有的分析方法進(jìn)行優(yōu)化，不斷開發(fā)新的高效的數(shù)據(jù)分析方法，進(jìn)一步提升單細(xì)胞測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。