豬德?tīng)査跔畈《綛J 株的分離鑒定與致病性分析

劉秋歌，王洪峰，范前進(jìn)，馮 力*，陳建飛*

（(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬消化道傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069；2.哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬德?tīng)査跔畈《荆≒orcine deltacoronavirus，PDCoV）是一種新發(fā)的豬冠狀病毒，能夠引起豬腸道疾病。該病主要以嘔吐、腹瀉、脫水和仔豬死亡為特征，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PDCoV是有囊膜的、單股正鏈RNA 病毒，是尼多目（Nido?virales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒亞科（Coronavirinae）德?tīng)査跔畈《緦伲―eltacoronavirus genus）成員。其基因組長(zhǎng)約25.4 kb，基因組結(jié)構(gòu)為：5'UTR-開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）1-S-E-M-ORF5-N-ORF7-3'UTR[1]。PDCoV 于2012 年在中國(guó)香港首次報(bào)道[2]，但PDCoV 是否具有臨床致病性在該研究中尚未報(bào)道。2014 年2 月PDCoV 在美國(guó)腹瀉豬群中首次出現(xiàn)，并蔓延至美國(guó)20 多個(gè)州以及加拿大的部分地區(qū)[3]。隨后，在韓國(guó)、中國(guó)大陸、泰國(guó)和越南等亞洲國(guó)家也發(fā)現(xiàn)了PDCoV[4]。

目前，對(duì)PDCoV 的分離培養(yǎng)主要采用豬腎細(xì)胞（LLC-porcine kidney，LLC-PK）和豬睪丸（Swine tes?tis，ST）細(xì)胞[5]。Hu 等利用LLC-PK 和ST 細(xì)胞成功從腹瀉仔豬的病料樣品中分離到PDCoV OH-FD22株，并對(duì)其致病性進(jìn)行了研究[6]。陳建飛等利用LLC-PK 細(xì)胞從黑龍江省某豬場(chǎng)腹瀉仔豬的病料樣品中成功分離得到國(guó)內(nèi)首株P(guān)DCoV NH 株[7]。本研究將經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)為PDCoV 陽(yáng)性的仔豬腹瀉樣品無(wú)菌處理后接種ST 細(xì)胞并進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，利用RT-PCR、間接免疫熒光法（IFA）、電鏡觀察、全基因組序列分析和致病性試驗(yàn)對(duì)分離的病毒株進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步開(kāi)展PDCoV 致病機(jī)制、診斷制劑和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料15 日齡～20 日齡仔豬小腸及內(nèi)容物采集自北京地區(qū)某豬場(chǎng)；胎牛血清購(gòu)自金源康公司；DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素、2.5%胰酶均購(gòu)自Gibco 公 司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 購(gòu) 自QIAGEN公司；PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit、Em?eraldAmp PCR Master Mix、pMD18-T 載 體 均 購(gòu) 自TaKaRa 公司；鼠抗PDCoV N 蛋白單克隆抗體（MAb）由本實(shí)驗(yàn)制備和保存；兔抗鼠FITC-IgG、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG（全分子）購(gòu)自Sigma 公司；山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluro 488 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen 公司。

1.2 病毒的分離及鑒定

1.2.1 病毒的分離 采用RT-PCR 方法對(duì)收集的病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，將PDCoV陽(yáng)性小腸內(nèi)容物樣品和滅菌PBS 按1∶5 的質(zhì)量體積比制成懸液，5 000 r/min，4 ℃離心10 min，吸取上清，0.45 μm 濾器過(guò)濾，接種ST 單層細(xì)胞，37 ℃吸附1 h 后用滅菌PBS 洗3 遍，添加維持液后繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞病變（CPE）。經(jīng)盲傳將出現(xiàn)CPE 的細(xì)胞及其上清液反復(fù)凍融3 遍后繼續(xù)傳代培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)90%以上的CPE 時(shí)，收獲病毒，噬斑純化后在ST 細(xì)胞上連續(xù)傳代至第13 代（P13）。

1.2.2 分離病毒的電鏡觀察 將第13 代細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融3遍后，取1 000 μL 4 ℃，5 000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞碎片，將上清于4 ℃，12 000 r/min離心30 min，棄掉大部分上清，利用剩余液體重懸沉淀，用2%磷鎢酸負(fù)染后經(jīng)透射電鏡觀察。

1.2.3 分離病毒的IFA 鑒定 同時(shí)，6 孔板中的ST 細(xì)胞感染病毒18 h后棄掉上清液，以4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min，經(jīng)0.1%Triton-X100 在室溫作用20 min，5%脫脂乳封閉1 h；以鼠抗PDCoV N 蛋白MAb 為一抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)陨窖蚩剐∈驣gG/Alexa Fluro 488 為二抗（1∶500稀釋?zhuān)?duì)分離的病毒進(jìn)行IFA鑒定。

1.2.4 分離病毒的PCR 鑒定 參照GenBank 中登錄的PDCoV HKU15-44 株全基因組序列（JQ065042），利用Oligo 6.0 設(shè)計(jì)1 對(duì)擴(kuò)增N 基因的特異性引物，引物序列為F：5'-TCAATGGTGAGCCTTTACTGCTT-3'/R：5'-ATCGGGATGTGATTCTGTGCTAG-3'。片段大小為1 209 bp，引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。取第13 代（P13）細(xì)胞培養(yǎng)液140 μL，參照QIAamp Viral RNA Mini Kit 說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；98 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；同時(shí)設(shè)病毒RNA 對(duì)照。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 病毒全基因組測(cè)序參照GenBank 中登錄的PDCoV HKU15-44 株全基因組序列（JQ065042），利用Oligo 6.0 設(shè)計(jì)19 對(duì)擴(kuò)增全基因組序列的特異性引物（如讀者需要，作者可以提供相關(guān)引物序列）。以P13 代病毒的cDNA 為模板，分別用19 對(duì)引物PCR擴(kuò)增目的片段。PCR 反應(yīng)條件同上，PCR 產(chǎn)物回收純化后克隆至pMD18-T 中，重組質(zhì)粒由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序，每個(gè)片段至少送3 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)分離株的基因組序列進(jìn)行比對(duì)、拼接。利用MEGA 7.0.26軟件中的NJ法構(gòu)建全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析分離株和參考株之間的親緣關(guān)系。

1.4 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)將4 頭3 日齡的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV）、PDCoV 抗原陰性的哺乳仔豬隨機(jī)分為感染組（n=2）和對(duì)照組（n=2）。感染組每頭豬口服105TCID50/mL 的BJ 株（P13）2 mL；對(duì)照組口服2 mL細(xì)胞維持液，接種后定時(shí)觀察仔豬的臨床表現(xiàn)。待出現(xiàn)臨床癥狀后迫殺全部仔豬，采集其腸組織于10%中性甲醛中固定，利用HE 染色觀察組織病變；同時(shí)，以PDCoV N 蛋白MAb（1∶25 稀釋?zhuān)橐豢?，以過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠HRP-IgG（全分子）（1∶400 稀釋?zhuān)槎?，進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗(yàn)，檢測(cè)各組豬腸組織中的病毒抗原。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒的分離及鑒定結(jié)果將無(wú)菌處理的PDCoV陽(yáng)性樣品接種到ST 細(xì)胞培養(yǎng)，盲傳至第3 代后出現(xiàn)典型的CPE；而對(duì)照組無(wú)明顯變化（圖1A）。經(jīng)噬斑純化后繼續(xù)傳代（圖1B）。取P13 代的病毒細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)電鏡觀察可見(jiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在典型的冠狀病毒粒子（圖1C）。以特異性的鼠抗PDCoV N 蛋白MAb 對(duì)病毒感染的ST 細(xì)胞進(jìn)行IFA 檢測(cè)，結(jié)果顯示病毒感染的ST 細(xì)胞中有特異性的熒光，而正常對(duì)照細(xì)胞未出現(xiàn)熒光（圖1D）。利用針對(duì)N 基因的特異性PCR 能夠檢測(cè)到目的條帶（圖1E）。綜上結(jié)果表明分離到一株P(guān)DCoV，并將其命名為BJ 株。研究表明在相同的條件下PDCoV 對(duì)LLC-PK 細(xì)胞中比對(duì)ST 細(xì)胞更易感，說(shuō)明LLC-PK 細(xì)胞更有利于PDCoV 的分離[8]。本研究在ST 細(xì)胞中分離傳代的BJ 株，P13 代的病毒滴度為105.75TCID50/mL；而Zhao 等在LLC-PK細(xì)胞分離的CHN-SC2015 在P10 代的病毒滴度為107TCID50/mL[9]；可能是因?yàn)镻DCoV 對(duì)ST 細(xì)胞的敏感性低于LLC-PK 細(xì)胞造成病毒在ST 細(xì)胞中增殖較慢。

2.2 全基因組序列同源性分析結(jié)果從BJ P13 代的細(xì)胞培養(yǎng)液中提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用設(shè)計(jì)的19 對(duì)引物進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（圖2A）。經(jīng)測(cè)序，序列拼接及比對(duì)后結(jié)果顯示，與參考株序列相比，PDCoV BJ 株的S 基因中缺失3 個(gè)堿基，這一點(diǎn)是除了CHN-AH-2004 外，其他中國(guó)病毒株所共有的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。纖突（Spike，S）基因編碼的S 蛋白在病毒表面形成三聚體，具有結(jié)合宿主受體、促進(jìn)膜融合和誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體等作用[10]。將PDCoV BJ 株的S 基因核苷酸序列以及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與本實(shí)驗(yàn)室分離的黑龍江地區(qū)NH 株進(jìn)行比對(duì)分析顯示，BJ 株與NH 株在S 基因上無(wú)核苷酸插入或缺失，但存在45 個(gè)核苷酸點(diǎn)突變，并導(dǎo)致其編碼的6 個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，分別為H21D、L45H、Y122H、V136A、T644A、I1015V。有研究將S 蛋白截成3 段并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組蛋白，對(duì)重組蛋白的免疫原性評(píng)價(jià)結(jié)果表明3 段重組蛋白產(chǎn)生的抗血清均具有中和病毒的能力，其中以S1 的CTD（aa278～aa616）表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)生的抗血清具有最強(qiáng)的中和效果[11]。BJ 株與NH 株S 基因核苷酸序列存在較多的突變，這些突變導(dǎo)致了S 蛋白6 個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變。這些突變對(duì)病毒的抗原性、病毒增殖能力和致病性影響有待后續(xù)研究?；贐J 株（P13 代）和PDCoV 國(guó)內(nèi)外參考株的全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，來(lái)自美國(guó)和韓國(guó)的PDCoV 聚集在一個(gè)大的分支中，而B(niǎo)J 株（紅色圓圈標(biāo)注）與中國(guó)檢測(cè)到的PDCoV聚集在一起，泰國(guó)、越南和老撾的PDCoV 聚集在一個(gè)明顯的分支中（圖2B）。因此，這些數(shù)據(jù)表明BJ株與中國(guó)大陸的PDCoV 株親緣關(guān)系較近，提示我國(guó)的PDCoV 可能來(lái)自一個(gè)共同的祖先。同時(shí)利用RDP4 軟件進(jìn)行了重組分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)BJ 株存在重組現(xiàn)象。

圖1 PDCoV BJ 株的分離鑒定結(jié)果Fig. 1 The isolation and identification of PDCoV BJ strain

圖2 PDCoV BJ 株全基因擴(kuò)增（A）和系統(tǒng)發(fā)育分析（B）Fig. 2 The complete genome amplification (A) and phylogenetic analysis (B) of PDCoV BJ strain

2.3 BJ株動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)結(jié)果口服接種BJ株后24 h，感染組2 頭仔豬表現(xiàn)為精神沉郁、厭食，無(wú)腹瀉?？诜臃N后27 h，感染組2 頭仔豬開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉癥狀，排出黃色水樣糞便；而對(duì)照組無(wú)異常表現(xiàn)。出現(xiàn)腹瀉后12 h 將仔豬全部迫殺，剖檢可見(jiàn)十二指腸、空腸、回腸腸壁變薄，其內(nèi)充滿(mǎn)氣體和黃色水樣稀便。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，感染豬回腸和空腸的小腸絨毛長(zhǎng)度顯著變短，而十二指腸、盲腸、結(jié)腸和直腸的絨毛與對(duì)照豬相比無(wú)顯著變化（圖3A）。免疫組化結(jié)果顯示，在感染豬的空腸和回腸檢測(cè)到大量PDCoV抗原，而在十二指腸、盲腸、結(jié)腸和直腸與對(duì)照組豬的相應(yīng)腸組織中未檢測(cè)到病毒抗原（圖3B），表明空腸和回腸是PDCoV BJ 株體內(nèi)感染和復(fù)制的主要部位。Zhang 等人對(duì)PDCoV NH 株在細(xì)胞中傳代10 次的病毒株進(jìn)行了致病性試驗(yàn)，結(jié)果表明NH P10 對(duì)5日齡仔豬具有強(qiáng)致病性[12]。本研究用于感染試驗(yàn)的BJ P13 株對(duì)3 日齡仔豬具有高致病性，其產(chǎn)生的組織病變與Zhang 等人的結(jié)果一致。Madson 等人的研究表明在PEDV 感染的小腸組織切片中均觀察到了病變[13]，而本研究中只在PDCoV BJ 株感染仔豬的空腸和回腸觀察到病變，表明PDCoV 引起的組織損傷比PEDV 引起的組織損傷輕。

圖3 PDCoV BJ 株感染豬和對(duì)照豬腸組織的病理變化（A）和抗原分布（B）Fig. 3 Histopathology (A) and antigen distribution (B) of PDCoV BJ strain in infected piglets and control piglets

由于目前無(wú)針對(duì)PDCoV 的特效治療藥和商品化疫苗，PDCoV 感染日趨普遍，為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了潛在威脅。此外，Jung 在研究中發(fā)現(xiàn)PDCoV 可以感染3 日齡～7 日齡犢牛并在糞便中檢測(cè)到病毒核酸，在血清中檢測(cè)到針對(duì)PDCoV 的特異性抗體[14]。PD?CoV 可以感染雞胚，能夠在雞胚上連續(xù)傳代但并不引起雞胚的死亡，接種SPF 雞可以引起輕度感染[15]。這些研究結(jié)果表明PDCoV 存在跨種間傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此加強(qiáng)PDCoV 的臨床檢測(cè)和病毒分離、鑒定是非常必要的。本研究分離到PDCoV BJ 株并對(duì)其致病性進(jìn)行了評(píng)估，獲得了分離株全基因組序列，對(duì)了解我國(guó)PDCoV 的遺傳演化具有重要意義，豐富了病毒資源庫(kù)，為進(jìn)一步研究該病毒的致病機(jī)制、診斷試劑研制和疫苗開(kāi)發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。