兩株鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性分析

陳國(guó)權(quán)，吳征卓，姚碧瓊，施大軍，王 娜，張?zhí)焯?，閻朝華，周碧君,3*，王開功,3，程振濤,3，文 明,3*

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.三穗縣鴨產(chǎn)業(yè)化建設(shè)管理辦公室，貴州 三穗 556500；5.貴州千里山生態(tài)食品股份有限公司，貴州 三穗 556500）

鴨疫里默氏桿菌（Riemrella anatipestifer，RA）屬于黃桿菌科里默氏菌屬，是一種有莢膜、無芽孢、無鞭毛的革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)菌，能感染鴨、鵝和火雞等多種禽類，引起以纖維素性心包炎、肝周炎和腦膜炎為主要病變的鴨疫里默氏桿菌病[1-2]。目前世界上報(bào)道過的RA 血清型至少有21 種，中國(guó)主要以血清1 型、2 型和10 型為主[3]。由于不同血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)，藥物治療在養(yǎng)鴨生產(chǎn)過程中仍是防治RA 感染的一種重要措施，但同時(shí)也致使RA 具有廣泛的耐藥性，RA 已成為影響全球養(yǎng)鴨業(yè)最主要的病原菌之一，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

外膜蛋白A（Outer membrane protein A，OmpA）作為一種主要蛋白廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中，維持細(xì)胞膜的完整性[6]。OmpA 是RA 一種主要的抗原決定簇，能誘導(dǎo)良好的保護(hù)性免疫，且具有高度保守性。OmpA 基因全長(zhǎng)1 164 bp，共編碼387 個(gè)氨基酸，通過對(duì)該基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測(cè)序可對(duì)RA作出鑒定[7]。本研究通過對(duì)臨床疑似RA 感染的瀕死鴨心和肝組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，通過生化試驗(yàn)、OmpA 基因擴(kuò)增和玻片凝集試驗(yàn)對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定，本研究首次證實(shí)了血清11 型RA 在貴州省的存在，豐富了貴州省RA 的流行病學(xué)資料。本研究對(duì)RA 分離株進(jìn)行致病性檢測(cè)和耐藥性分析，以期了解RA 的致病機(jī)制和耐藥機(jī)制，為更好地防控RA 和開展相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源及陽(yáng)性菌株2019 年12 月，貴州省三穗縣2 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)（分別用A、B 代替）雛鴨出現(xiàn)爆發(fā)性死亡病例。A、B 養(yǎng)鴨場(chǎng)原存欄雛鴨分別為11 000 只和9 700 只，均從11 日齡出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，至調(diào)查日（A 場(chǎng)雛鴨16 日齡、B 場(chǎng)雛鴨14 日齡）已分別死亡8 000 余只和2 000 余只。2 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)發(fā)病雛鴨的臨床癥狀相似，以神經(jīng)癥狀和運(yùn)動(dòng)障礙為主。每個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)分別采集處于瀕死期的5 只雛鴨的心、肝和脾組織用于病原分離。RA-SS1 陽(yáng)性菌株由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所鑒定并保存。

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ均 購(gòu) 自TaKaRa 公司；Gel Extration Kit、Plasmid Mini Kit 購(gòu) 自O(shè)mega 公司；革蘭氏染液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、微量生化鑒定管、藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；4%多聚甲醛購(gòu)自BOSTER 公司。10 日齡健康雛鴨來源于貴州省三穗縣興綠洲農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成參照雷云等[8]合成RA OmpA全基因引物；參照包細(xì)明等[9]和張亞楠等[10]合成RA常見的氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ib、喹諾酮類耐藥基因oqxB、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermF、四環(huán)素類耐藥基因tet（X）、氯霉素類耐藥基因floR、整合子酶基因IntI1 的引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)無菌采集處于瀕死期雛鴨的心、肝和脾組織，劃線接種于巧克力培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2倒置培養(yǎng)，24 h 后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，挑取形態(tài)特征一致的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察染色特性及形態(tài)。通過培養(yǎng)特性，菌落、菌體形態(tài)，染色特性進(jìn)行初步判定，將特征型單個(gè)菌落接種于TSB（含5%新生牛血清）培養(yǎng)基中進(jìn)行純化增殖培養(yǎng)備用。

1.5 分離菌的生化鑒定參考雷云[8]等和包細(xì)明[9]等選取用于鑒定RA 的微量生化鑒定管，無菌取分離菌純培養(yǎng)菌液接種于生化鑒定管，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.6 分離菌OmpA基因的PCR 鑒定及序列分析無菌吸取1.5 mL 菌液于離心管，利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌總DNA。以分離菌基因組為模板，采用OmpA 基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[8]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用膠回收試劑盒回收純化目的基因。將目的基因連接至pMD19-T 載體，按分子克隆技術(shù)常規(guī)操作進(jìn)行目的基因的克隆，挑取經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒由華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與參考序列應(yīng)用MegAlign 進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，采用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹及分析。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.7 分離菌的血清型鑒定將純化后的RA 送至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，使用血清1 型～13 型、16 型RA 陽(yáng)性血清對(duì)2 株RA 進(jìn)行血清型鑒定。

1.8 分離菌感染雛鴨的回歸試驗(yàn)挑選飼養(yǎng)至10 d的15 只健康雛鴨，隨機(jī)分為2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1 個(gè)對(duì)照組，每組各5 只。實(shí)驗(yàn)組雛鴨分別腿部肌肉注射0.5 mL RA 不同分離株菌液（菌液濃度調(diào)制為3×108cfu/mL），對(duì)照組雛鴨腿部肌肉注射等量無菌TSB（含5%新生牛血清），每天按時(shí)觀察雛鴨臨床癥狀與死亡情況，直至攻毒后第7 d。取攻毒后瀕死雛鴨的心、肝、脾及腦組織用4%多聚甲醛固定，由武漢塞維爾生物科技有限公司制作病理切片，通過病理切片進(jìn)行組織病理變化觀察。

1.9 分離菌的藥敏試驗(yàn)根據(jù)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）[11]的要求，采用紙片擴(kuò)散法（K-B 法）對(duì)分離菌進(jìn)行青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氯霉素類和磺胺類等8 類抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。

1.10 分離菌的耐藥基因檢測(cè)以分離菌DNA 為模板，采用aac（6'）-Ib（氨基糖苷類）、oqxB（喹諾酮類）、ermF（大環(huán)內(nèi)酯類）、tet（X）（四環(huán)素類）、floR（氯霉素類）和IntI1（整合子酶基因）等6 種耐藥基因引物（10 μmol/L）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[9-10]，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及菌體形態(tài)觀察結(jié)果無菌接種瀕死鴨心和肝組織于巧克力瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。結(jié)果顯示，從2 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)瀕死雛鴨肝組織內(nèi)各分離到1 株疑似菌株，該分離菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基中均無菌落生長(zhǎng)，在巧克力培養(yǎng)基可見表面光滑、邊緣整齊、半透明、中央微突起的露滴樣小菌落。2 株分離菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)均為革蘭陰性短小桿菌，多數(shù)呈單個(gè)狀態(tài)，少數(shù)成對(duì)或呈短鏈狀排列（圖1）。分離菌菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢形態(tài)與RA 相符，將2 株分離菌分別命名為GZ-SS01 和GZ-SS02。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（×1 000）Fig. 1 Microscopic examination of the isolateds with Gram stain (×1 000)

2.2 分離菌生化鑒定結(jié)果無菌接種分離菌純培養(yǎng)物于微量生化管中進(jìn)行生化特性觀察。結(jié)果顯示，2 株分離菌均能分解尿素；氧化酶、觸酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性；不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖；不水解賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸；硝酸鹽還原、硫化氫、甘露醇、靛基質(zhì)和VP-MR 試驗(yàn)均為陰性。分離菌生化特性與RA 相符，結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)特性、染色鏡檢結(jié)果及生化特性可初步判定2 株分離菌為RA。

2.3 分離菌OmpA基因的PCR 鑒定及序列分析結(jié)果以GZ-SS01 和GZ-SS02 分離菌的基因組為模板，采用OmpA 基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果均獲得約為1 200 bp 的目的條帶（圖2A）；使用BamHⅠ、Hind Ⅲ對(duì)重組質(zhì)粒雙酶切，可見約為1 200 bp的基因條帶和約為2 700 bp 的載體條帶（圖2B）。將測(cè)序獲得的OmpA 基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中參考菌株OmpA基因序列進(jìn)行分析，核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 株分離株與15 株RA 參考株的OmpA 基因序列的同源性高達(dá)93%～99.9%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，2 株分離株與8 株RA 參考株的OmpA 基因序列聚為一簇，且置信度為100%；GZ-SS01 株與JL-RA1 株（HQ707077.1）和GZ-RA2 株（KY399233.1）親 緣 關(guān)系最近，GZ-SS02 株與GZ-RA3 株（KY399234.1）親緣關(guān)系最近（圖2B）。綜合分離菌的形態(tài)學(xué)特征、生化特性及OmpA 基因序列分析結(jié)果，判定這2 株分離菌均為RA。

圖2 基于OmpA 基因的PCR 擴(kuò)增、酶切鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 2 PCR amplification, enzyme digestion identification and phylogenetic tree analysis based on OmpA gene

2.4 分離菌血清型鑒定結(jié)果經(jīng)玻片凝集試驗(yàn)對(duì)分離菌進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示，GZ-SS01 株和GZSS02株與血清11型陽(yáng)性血清反應(yīng)均能出現(xiàn)清晰的乳白色絮狀凝集塊，與血清1～10、12～13和16型陽(yáng)性血清均無明顯變化，由此判定2株分離菌均為血清11型RA。

2.5 分離菌感染雛鴨的致病性試驗(yàn)結(jié)果兩組實(shí)驗(yàn)雛鴨經(jīng)腿部肌肉分別注射不同分離株菌液，連續(xù)觀察7 d。結(jié)果顯示，感染12 h 后，兩組實(shí)驗(yàn)雛鴨均出現(xiàn)頭頸歪斜、站立不穩(wěn)等明顯臨床癥狀；24 h 后開始出現(xiàn)死亡，呈現(xiàn)角弓反張狀；48 h～60 h 達(dá)到死亡高峰期，其間死亡率達(dá)60%（6/10）；90 h 后兩組實(shí)驗(yàn)雛鴨全部死亡。瀕死鴨心、肝和脾組織接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基均能分離得到與原分離菌形態(tài)一致的菌落。對(duì)照組雛鴨在觀察期均未出現(xiàn)感染癥狀或死亡。剖檢瀕死雛鴨，均能明顯觀察到心、肝及氣囊表面附有纖維素性滲出物。觀察人工感染90 h后瀕死鴨組織病理變化可見：心外膜增厚，表面附有大量粉紅色網(wǎng)狀纖維素滲出物，有大量單核細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)（圖3E）；肝被膜水腫增厚，表面有粉紅色網(wǎng)狀纖維滲出，混有大量淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞（圖3F）；脾被膜水腫增厚，聚集有大量粉紅色纖維素滲出，異嗜性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，紅髓與白髓界限不清（圖3G）；腦膜充血、水腫增厚，有粉紅色網(wǎng)狀纖維滲出，其間可見淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞彌散性浸潤(rùn)（圖3H）。臨床癥狀及病理變化與發(fā)病鴨一致，表明兩株分離株為該疫情的病源菌，且對(duì)雛鴨均具有較強(qiáng)的致病性。

2.6 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，2 株分離菌對(duì)哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢拉定、頭孢氨芐、氧氟沙星和米諾環(huán)素等7 種抗菌藥物敏感；對(duì)青霉素類（羧芐西林和氨芐西林）、氨基糖苷類（丁胺卡那、慶大霉素和新霉素）、大環(huán)內(nèi)脂類（阿奇霉素、紅霉素和麥迪霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素和多西環(huán)素）和氯霉素類（氟苯尼考）等5 類11 種抗菌藥物耐藥（表2），2株分離菌均屬于5重耐藥菌株。

圖3 RA 人工感染雛鴨90 h 后組織病理學(xué)觀察結(jié)果Fig. 3 Histopathological observation results after 90 hours of artificial infection of ducks with Riemerella anatipestifer

表2 鴨疫里默氏桿菌分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug sensitivity test of Riemerella anatipestifer isolates

2.7 分離菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果以合成的耐藥基因引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，2 株分離菌均攜帶氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ib（486 bp）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermF（460 bp）、四環(huán)素類耐藥基因tet（X）（1 167 bp）、氯霉素類耐藥基因floR（673 bp）和整合子酶基因IntI1（280 bp）等5 種耐藥基因，均不攜帶喹諾酮類耐藥基因oqxB（755 bp）（圖4），耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與耐藥表型結(jié)果除四環(huán)素類中米諾環(huán)素耐藥情況不一致外其余均一致。

圖4 分離菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 PCR amplification results of drug resistance genes of the two isolates

3 討 論

RA 對(duì)1～8 周齡的雛鴨具有很強(qiáng)的致病性，RA血清型眾多且各型之間缺乏交叉免疫保護(hù)，掌握各個(gè)地區(qū)RA 的優(yōu)勢(shì)血清型對(duì)于該地RA 疫苗株的選擇具有重要意義[12]。目前對(duì)RA 進(jìn)行血清型鑒定主要為玻片凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)等血清學(xué)分型法，但該法需依賴陽(yáng)性血清才能進(jìn)行血清型分型[13]。本研究發(fā)現(xiàn)2 株血清11 型RA 分離株與其他血清型RA參考株仍處于同一基因群，進(jìn)一步證實(shí)基于OmpA基因分型與血清型分型無直接關(guān)聯(lián)。OmpA 是RA 引起細(xì)胞粘附、侵襲和血清抗性的主要毒力因子，存在于所有RA 血清型中，且遺傳異質(zhì)性較小[14]。謝永平等針對(duì)OmpA 基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物和探針建立了快速、精準(zhǔn)檢測(cè)RA 的qPCR 方法[6]；包細(xì)明等選用OmpA 基因序列建立了快速診斷RA 的多重PCR 方法，可見能選用該段基因?qū)A 作出鑒定[15]，但無法判斷RA 血清型。

不同血清型RA 感染鴨引起的臨床癥狀和病理變化基本相似，多伴有神經(jīng)癥狀的纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。袁小遠(yuǎn)等研究指出血清1 型RA 感染癥狀主要表現(xiàn)為縮頸、運(yùn)動(dòng)困難等癥狀；以心、肝和氣囊等漿膜表面出現(xiàn)明顯的纖維素性滲出為主要病變[16]。雷云等用分離到的血清2 型RA 進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示，攻毒后的實(shí)驗(yàn)鴨表現(xiàn)明顯的歪頭縮頸的神經(jīng)癥狀；剖檢見心、肝組織表面均有纖維素性滲出物，脾臟充血腫大等病理變化[17]。楊曉輝等用分離到的血清11 型RA 進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示，攻毒后的實(shí)驗(yàn)鴨表現(xiàn)出頭頸震顫癥狀，剖檢可見纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎[18]。本研究用分離到的2 株血清11 型RA 進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)鴨主要以運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)癥狀為主；病變主要以纖維素性心包炎、肝周炎和腦膜炎為主，部分還表現(xiàn)有脾被膜水腫增厚等病理變化。關(guān)于血清11 型RA 感染鴨的組織病理變化的研究報(bào)道相對(duì)較少，本研究通過對(duì)該型RA 感染鴨進(jìn)行組織病理學(xué)分析，豐富了該型RA 的病理資料，為該型RA 的致病機(jī)理研究提供參考。血清11 型RA與1、2 型RA 感染引起的癥狀與病變基本一致，且對(duì)雛鴨都具有很強(qiáng)的致病性，因此很難通過觀察癥狀和病變對(duì)RA 血清型進(jìn)行區(qū)分。本研究首次證實(shí)了血清型11 型RA 在貴州的存在，為該地區(qū)科學(xué)全面地防控RA 指明了新的方向。

抗菌藥物的廣泛使用使RA 對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，并出現(xiàn)了多重耐藥菌株。研究表明RA對(duì)多種抗菌藥物具有天然抗性，RA 臨床分離株對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、氯霉素類和四環(huán)素類抗菌藥物具有不同程度的耐藥性[4,19]。朱元軍等對(duì)我國(guó)南方部分地區(qū)120 株RA 進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)部分氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類和四環(huán)素類抗菌藥物產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，且氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ib 的檢出率高達(dá)74.1%（89/120）[20]。任曉梅等對(duì)46 株RA 進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)氨芐西林、新霉素和紅霉素等抗菌藥物高度耐藥[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 株RA 對(duì)所檢測(cè)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和氯霉素類抗菌藥物耐藥，與以上研究結(jié)果基本一致；2 株RA 對(duì)喹諾酮類藥物較敏感，與朱德康等[4]和任曉梅等[21]研究結(jié)果不一致。耐藥基因 檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示，2 株RA 都 攜 帶aac（6'）-Ib、ermF、tet（X）、floR 和IntI1 等5 種耐藥基因，除四環(huán)素類中米諾環(huán)素耐藥表型與基因型不一致外，其余耐藥表型與基因型基本相符。通過對(duì)RA 的耐藥表型和基因型進(jìn)行比較分析可以確定RA 對(duì)某種抗菌藥物的耐藥程度，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)[22]。

本研究從貴州省三穗縣2 個(gè)養(yǎng)鴨場(chǎng)疑似RA 感染的瀕死鴨肝組織中分離到2 株血清11 型RA，首次證實(shí)了血清11 型RA 在貴州省的存在，且均能復(fù)制出RA 感染引起的典型臨床癥狀與病理變化，均具有較強(qiáng)的致病性。2 株RA 對(duì)頭孢類和喹諾酮類抗菌藥物較為敏感，對(duì)部分青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氯霉素類等5 類抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，且耐藥表型與基因型基本一致。