6例成人t(4；11)(q21；q23)急性淋巴細胞白血病的遺傳學(xué)研究

劉雯，米瑞華，胡杰英

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院 a.中心實驗室；b.血液科，河南 鄭州 450008)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種常見的惡性血液病，以骨髓和淋巴組織中不成熟淋巴細胞的異常增殖和聚集為特點，生物學(xué)特征多樣，臨床異質(zhì)性很大[1]。ALL的特異性染色體重排與白血病細胞的免疫學(xué)亞型相關(guān)。染色體易位t(4；11)(q21；q23)見于2%～6%的ALL，免疫學(xué)分型方法顯示前或早前急性B淋巴細胞白血病表型，分子學(xué)檢測揭示該易位導(dǎo)致原來位于4號染色體長臂2區(qū)1帶(q21)的AF4基因和位于11號染色體長臂2區(qū)3帶(q23)的混合譜系白血病基因(mixed lineage leukemia，MLL)并置在一起，形成了MLL-AF4融合基因[2]。在MLL-AF4融合基因顯示陽性的ALL患者中，50%是不滿6個月的嬰兒，稍大一點的嬰兒占10%～20%，成人占7%[2]。嬰幼兒中完全緩解率(complete remission，CR)為88%，但中位總體生存時間(median overall survival，OS)僅為10個月。在成人患者中，CR為88%，但OS也僅為7個月[2]。多數(shù)患者在臨床治療中會對現(xiàn)有常規(guī)化療耐藥，進行造血干細胞移植、生物治療、聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(combined antiretroviral therapy，cART)后也容易復(fù)發(fā)，是一個獨立的預(yù)后不良因素，其發(fā)病機制不明，暫缺乏有效的靶向治療措施。本研究對6例成人t(4；11)(q21；q23)急性淋巴細胞白血病應(yīng)用RT-RCR檢測融合基因，并通過熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)檢測加以驗證，對臨床和實驗室特點亦進行了總結(jié)，以提高對成年伴t(4；11)(q21；q23)急性淋巴細胞白血病的認識。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2014年4月至2020年4月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院染色體檢測標本共9 662例，其中初診ALL 323例，占3.34%。伴t(4；11)(q21；q23)急性淋巴細胞白血病7例，占ALL的2.17%，女4例，男3例，1例為兒童，6例為成人，成人中位發(fā)病年齡40歲。6例患者均接受血常規(guī)、細胞形態(tài)學(xué)、細胞遺傳學(xué)、MLL-AF4融合基因檢測、免疫分型檢測、FISH檢測。

1.2 染色體核型分析方法染色體標本采用R顯帶法分析，取患者骨髓標本，每份標本分別用小牛血清和1640培養(yǎng)液常規(guī)短期培養(yǎng)，秋水仙堿阻滯細胞停留在細胞分裂中期，使用氯化鉀低滲，經(jīng)甲醇/冰乙酸固定液(甲醇和乙酸體積比為3∶1)固定后制片，Earle’s顯帶液顯帶，Giemsa染色液染色。運用德國ZISS公司生產(chǎn)的染色體全自動掃描分析系統(tǒng)掃描采集中期細胞圖像，核型異常識別和描述參照《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)》。

1.3 MLL-AF4檢測方法對MLL-AF4基因采用實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription，RT-PCR)檢測，抽取患者外周血2 mL，提取總RNA，以ABL基因為內(nèi)參基因。

1.4 免疫分型應(yīng)用流式細胞儀間接免疫熒光法和一組單抗檢測腫瘤細胞的表面抗原。判斷標準為胞質(zhì)抗原≥10%為陽性，細胞膜表面抗原≥20%為陽性。

1.5 FISH檢測MLL基因重排檢測探針購自美國雅培公司，-20 ℃保存?zhèn)溆?。MLL雙色斷裂重排探針是用于檢測11號染色體2區(qū)3帶MLL基因的易位與重排。標本用探針標記后在Olympus BX51熒光顯微鏡的DAPI/FITC/TRITC三色濾光鏡下觀察細胞熒光雜交信號：兩黃色熒光信號者為MLL斷裂重排陰性細胞，一紅一綠一黃色熒光信號者為MLL基因斷裂重排陽性細胞，每例至少分析200個間期細胞。計算陽性細胞的比率。應(yīng)用VideoTest FISH 2.1圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集并保存。

2 結(jié)果

2.1 臨床和血液學(xué)特點初診時外周血中位白細胞計數(shù)為268(2.16～638)×109L-1，中位血小板計數(shù)為85(15～148)×109L-1，中位血紅蛋白53.5(36～76)g·L-1，中位骨髓原始、幼稚淋巴細胞百分比66.8%(37.5%～91%)，中位總體生存期10(6～41)個月。

2.2 染色體核型分析6例患者的染色體核型結(jié)果見表1。例1、2、3、6核型為單純t(4；11)(q21；q23)(圖1)，例4同時合并衍生4號染色體(der4)，例5合并衍生10號染色體異常(der10)。

表1 6例伴t(4；11)急淋患者細胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及治療反應(yīng)

圖1 核型異常的骨髓樣本的細胞遺傳學(xué)分析(箭頭示易位染色體)

2.3 RT-PCR對6例患者進行RT-PCR檢測，均為MLL-AF4融合基因陽性。

2.4 流式免疫分型以異常幼稚B淋巴細胞為主，例1表達CD19、CD22、CD123、HLA-DR、cCD9a、CTDT，弱表達CD38、CD15。例2表達CD45、CD19、CD38、CD123、CD10-、CD34-、CD20-。例3表達CD38、HLR-DR、CD19、CD15、CD22、cCD79。例4表達CD19、CD38、CD58，部分表達CD22、CD123、cCD79a。例5表達CD19、CD38、HLA-DR、cCD22、cTDT、cCD79a，部分表達CD2，弱表達CD15。例6異常淋系表型，表達CD19、CD38、CD81、CD200、CD43、cCD79a，少部分表達CD10。

2.5 FISH檢測6例患者均經(jīng)FISH檢測證實為MLL基因分離重排陽性。

3 討論

本研究中6例成人t(4；11)(q21；q23)染色體易位的患者臨床診斷均為急性淋巴細胞白血病，研究表明該易位產(chǎn)生MLL-AF4融合基因。MLL-AF4融合基因又稱為組蛋白賴氨酸[K]-甲基轉(zhuǎn)移酶2A基因(KMT2A-AFF1基因)，KMT2A-AFF1融合蛋白參與造血干細胞的自我更新分化，高表達引起不良預(yù)后[3]。t(4；11)(q21；q23)染色體易位與急性淋巴細胞白血病高度相關(guān)，歐洲1lq23協(xié)作組曾報道過183例伴t(4；11)的急性白血病，在這些病例中絕大部分(94.5%)為ALL，證實了t(4；11)和ALL高度相關(guān)[4]。

t(4；11)(q21；q23)染色體易位的ALL臨床表現(xiàn)常伴肝脾大、淋巴結(jié)浸潤；本組患者染色體核型分析有附加異常2例，無附加異常單純4例，11易位的4例，免疫表型以異常B淋巴細胞為主，6例患者均表現(xiàn)為MLL基因重排，這種重排會導(dǎo)致極差的急性淋巴細胞白血病預(yù)后，疾病惡性程度很高，5例死亡，1例發(fā)病8個月，目前仍在治療中。雖然這種類型白血病中成人占比較低，但如何提高這類疾病的預(yù)后仍是需要去探索的問題。由于患者對化療的不敏感以及腫瘤較高的惡性程度，除了針對性解決外周血白細胞升高、血小板降低、貧血等臨床癥狀，預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的發(fā)生，異基因造血干細胞移植也是這類患者獲得長期無病生存、重建免疫功能及造血功能的重要治療策略。但一些患者由于疾病進展太快，無法找到適合移植的供者，同時也面臨著移植費用較高及移植后存在排異反應(yīng)風險的難題。

對比6例患者的免疫表型發(fā)現(xiàn)，均表達CD19特異性蛋白，其中有1例患者接受了嵌合抗原受體基因修飾靶向B細胞惡性腫瘤抗原CD19(CART-19)的免疫細胞治療臨床試驗，但并沒有取得很好的療效，原因可能在于復(fù)發(fā)后疾病進展比較迅速，如果在疾病早期盡早干預(yù)可能會取得更好的效果，對于效果的驗證需要更多的臨床數(shù)據(jù)來支撐。國內(nèi)很多實驗室都成功建立了CART-19細胞的體外擴增體系，體外殺傷實驗確定CART-19細胞能特異殺傷CD19陽性的腫瘤細胞[5]。但只有在解決了安全性、有效性等問題后，才能廣泛應(yīng)用于臨床治療。

最新的一項研究是MLL-AF4通過激活關(guān)鍵靶基因促進白血病的發(fā)生，一個關(guān)鍵的MLL-AF4靶基因是PROM1，它編碼了CD133[6]；CD133是一種5次跨膜糖蛋白，它代表了一種潛在的泛癌靶點，存在于多種癌癥干細胞中；異常的PROM1/CD133表達對于白血病細胞生長是必需的，由MLL-AF4基因的直接結(jié)合介導(dǎo)；上述結(jié)果提供了第1個詳細的分析方案，解釋了CD133在巨噬細胞白血病細胞中的表達。PROM1/CD133作為潛在治療靶標最吸引人的特征之一來自于對該基因是MLL-AF4調(diào)節(jié)的直接靶標的認識[7]，這表明在t(4；11)白血病中PROM1/CD133的表達與融合蛋白本身的活性緊密相關(guān)。了解這些機制可能是將來在這類白血病中開發(fā)PROM1/CD133導(dǎo)向的靶向治療的關(guān)鍵。