miR-100-5p用于肝癌患者預(yù)后判斷的臨床意義分析

何興楨 潘翔 鄭培奮

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是常見的惡性腫瘤之一，其預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅我國人口的健康[1-2]。HCC早期癥狀不典型，起病隱匿，且具有高惡性程度、高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移率等特點，因此盡管目前對于HCC的治療方法逐漸增多，包括手術(shù)治療、介入治療、放化療及靶向治療等[3]，但HCC患者預(yù)后仍不理想。因此，如果能夠發(fā)現(xiàn)HCC早期診斷、治療以及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，將對臨床診療有重要的意義。

隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，目前生物信息學(xué)在腫瘤中的應(yīng)用越來越廣，通過生物信息學(xué)分析尋找HCC中異常表達的基因，可為尋找HCC的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，由于miRNA在組織、血漿中可穩(wěn)定存在，并在腫瘤組織中存在異常表達，且可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等細(xì)胞學(xué)進程，是可選的生物標(biāo)志物之一[4-5]。miR-100-5p作為miRNA家族的一員，在膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤中均存在異常表達，并和疾病分期及預(yù)后相關(guān)[6-7]。而在HCC中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-100-5p表達水平低于正常肝臟組織，與患者預(yù)后相關(guān)，且過表達miR-100-5p可抑制HCC進展[8-9]。為進一步明確miR-100-5p在HCC患者預(yù)后中的臨床意義，本研究通過生物信息學(xué)分析及組織標(biāo)本表達檢測，評估m(xù)iR-100-5p用于不同臨床特征HCC患者預(yù)后監(jiān)測的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2004年1月至2013年12月于浙江醫(yī)院就診的HCC患者118例，其中男77例，女41例，年齡 21～79（50.29±14.00）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲；（2）患者需經(jīng)病理確診為HCC（診斷依據(jù)為2010版AJCC癌癥分期手冊），有完整的臨床數(shù)據(jù)及隨訪信息；（3）患者不存在其他原發(fā)腫瘤相關(guān)疾病。末次隨訪時間為2018年12月，所有患者均知情同意，本研究經(jīng)浙江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBRGreen PCR kit試劑盒均購自中國賽默飛世爾科技有限公司；miR-100-5p前引物購自中國上海吉馬生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法 獲取HCC石蠟組織塊，按說明書方法使用Trizol提取標(biāo)本中總RNA，并測定提取得到的總RNA濃度，以1 μg總RNA為底物，在普通PCR儀上進行逆轉(zhuǎn)錄。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。反應(yīng)條件：37℃，60 min；95℃，5 min。以cDNA為模板，使用miScript SYBR-Green PCR kit試劑盒進行RT-qPCR檢測。RT-qPCR所用引物如下：miR-100-5p前引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAACCCGTAGATCCGA-3′，后引物：通用引物。內(nèi)參U6前引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；后引物:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)體系：模板cDNA1μl，miR-100-5p上游引物1 μl，10*miScript通用引物 2 μl，2*Quanti TectS YBR Green PCR Master Mix 10 μl，加無酶水至總反應(yīng)體積20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃，15 min；94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70℃，30 s；共計40個循環(huán)。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)庫驗證 TCGA數(shù)據(jù)庫（www.cancergenome.nih.gov）中可獲取HCC患者預(yù)后數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)庫中患者預(yù)后信息和miR-100-5p表達水平繪制生存曲線，以miR-100-5p表達水平中位數(shù)為界，將患者分為miR-100-5p低表達組和高表達組。采用log-rank檢驗進一步驗證miR-100-5p和HCC患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier分析和log-Rank檢驗繪制生存曲線；采用單變量和多變量Cox回歸分析miR-100-5p和患者預(yù)后的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織miR-100-5p低表達、高表達與臨床特征的關(guān)系 miR-100-5p低表達、高表達與臨床分期有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤長徑無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 HCC組織miR-100-5p表達和患者預(yù)后的關(guān)系對影響HCC預(yù)后的相關(guān)臨床因素進行單因素和多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤高分期和miR-100-5p低表達是HCC預(yù)后的獨立危險因素（均P＜0.05），其HR值及95%CI分別為 0.269（0.138～0.523）、2.569（1.277～5.169），見表 2。

miR-100-5p低表達組預(yù)后生存率明顯低于高表達組患者（P＜0.01，圖1a），這和TCGA數(shù)據(jù)庫中的預(yù)測的結(jié)果相同（P＜0.01，圖1c）。且高分期（Ⅲ+Ⅳ期）HCC患者預(yù)后生存率低于低分期（Ⅰ+Ⅱ期）組（P＜0.01，圖1b）。并且在不同亞組中miR-100-5p表達水平與HCC預(yù)后關(guān)系各不相同，其中在高分期（圖2b）、低齡（≤60歲）（圖 2c）、男性（圖 2e）、小組織（腫瘤長徑≤5 cm）組（圖2g）中，低表達miR-100-5p患者的生存時間更短差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而在低分期（圖2a）、高齡（＞60歲）（圖2d）、女性（圖 2f）、大組織（腫瘤長徑＞5 cm）組（圖2h）中均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（均P＞0.05）。另外，在大組織、女性亞組中miR-100-5p高表達和低表達組可觀察到不同預(yù)后趨勢，雖然差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但不能排除樣本量過少所致偏倚，需擴大樣本量后進一步驗證。

表1 HCC組織miR-100-5p低表達、高表達與臨床特征的關(guān)系（例）

表2 HCC組織miR-100-5p表達與患者預(yù)后關(guān)系分析

圖1 miR-100-5p表達及腫瘤分期與患者預(yù)后生存的關(guān)系（a：石蠟標(biāo)本miR-100-5p低、高表達患者預(yù)后分析；b：石蠟標(biāo)本不同分期肝細(xì)胞癌患者預(yù)后分析；c：TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-100-5p低、高表達患者預(yù)后分析）

3 討論

HCC作為常見的惡性腫瘤，其惡性程度高、預(yù)后差，對國民的生命健康產(chǎn)生了巨大的威脅。因此，提高HCC的診斷與治療水平有著重要的臨床意義。近年來HCC相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了越來越多新的生物標(biāo)志物，但并無哪個標(biāo)志物是完全理想的。目前，miRNA分子在HCC中的作用機制和臨床意義被許多學(xué)者所關(guān)注，多種miRNA（如miR-217、miR-148a、miR-17等[10-12]）被發(fā)現(xiàn)在HCC組織中異常表達，并和HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。另外，miRNA分子在體外相對穩(wěn)定，且易于檢測，有作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于HCC診斷、預(yù)后判斷的可能。研究發(fā)現(xiàn)，miR-215、miR-150、miR-99a 等[13-15]miRNA 在 HCC組織中表達降低，miR-96、miR-155、miR-106b-5p等[14，16]在HCC組織中表達升高，這些在患者血漿或組織中異常表達的miRNA和患者臨床分期相關(guān)，這將可能用于HCC的早期診斷或靶向治療，并對判斷腫瘤的惡性程度和預(yù)后有著一定的臨床意義。

近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)miR-100-5p在腫瘤中存在異常表達，并具有一定臨床意義。如在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，低表達miR-100-5p提示患者預(yù)后較差[17]。在非肌層浸潤膀胱癌組織中，miR-100-5p低表達組的膀胱癌患者無疾病進展時間和腫瘤特異生存時間明顯長于高表達組，具有臨床意義[6]。在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，血清miR-100-5p低表達患者預(yù)后生存時間明顯低于高表達患者，這表明miR-100-5p可用于判斷患者的預(yù)后[7]。

圖2 各個不同亞組miR-100-5p表達與患者總體預(yù)后生存的關(guān)系（a：低分期亞組；b:高分期亞組；c：低齡亞組；d：高齡亞組；e：男性亞組；f：女性亞組；g：小組織亞組；h：大組織亞組）

在HCC中，已有關(guān)于miR-100功能或臨床意義的相關(guān)報道。Ge等[8]研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-100可通過抑制HCC細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制HCC細(xì)胞的增殖。另一項研究發(fā)現(xiàn)，miR-100和miR-125b可通過抑制血管生存從而抑制HCC的轉(zhuǎn)移[18]。以上研究均表明，miR-100可能作為HCC靶向治療的靶點之一。

前期已有Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-100在HCC組織中表達降低，且是HCC預(yù)后的獨立危險因素。本研究通過石蠟標(biāo)本檢測miR-100-5p在HCC組織中的表達，并分析其表達水平和患者臨床特征間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達miR-100-5p和HCC較高的臨床分期具有相關(guān)性，且低表達miR-100-5p患者預(yù)后較差，該結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致。進一步的亞組分析結(jié)果顯示，該結(jié)論在高分期、低齡、男性、腫瘤組織≤5 cm患者中依然適用。在低分期、高齡、女性、大組織亞組中，miR-100-5p表達和患者預(yù)后并無相關(guān)性。

綜上所述，本研究通過樣本檢測及TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，HCC組織miR-100-5p表達水平可用于預(yù)測HCC患者預(yù)后。miR-100-5p低表達是HCC患者預(yù)后較差的獨立危險因素。在高分期、低齡、男性、腫瘤組織≤5 cm HCC患者，miR-100-5p低表達提示著較差的預(yù)后，在女性、腫瘤組織＞5 cm HCC患者中miR-100-5p的臨床意義有待進一步驗證。