PCR-Sanger測(cè)序法在幽門(mén)螺桿菌感染個(gè)體化治療中的應(yīng)用研究

周晴接 孟飛 朱麗明 蔣曉芬 朱方超 潘杰

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）是消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴組織樣淋巴瘤的主要致病因子，根除Hp對(duì)治療和預(yù)防上述疾病具有重要意義[1]。然而，隨著抗生素的廣泛使用，Hp對(duì)常用抗生素的耐藥率越來(lái)越高，傳統(tǒng)Hp根除治療方案的根除率越來(lái)越低。目前Hp根除治療失敗的原因包括抗生素的選擇、患者依從性、地區(qū)因素、宿主因素、質(zhì)子泵抑制劑（PPI）代謝等，其中細(xì)菌耐藥是最主要的原因。因此，如何正確選擇抗生素并制定個(gè)體化治療方案是根治Hp的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)Hp的耐藥性與其相應(yīng)的基因耐藥位點(diǎn)相關(guān)，如23S rRNA基因（克拉霉素耐藥位點(diǎn)）、gyrA基因（喹諾酮耐藥位點(diǎn)）等，通過(guò)對(duì)Hp進(jìn)行耐藥基因測(cè)序，即可得到該耐藥位點(diǎn)的信息，從而推斷出耐藥情況[2-3]。本研究通過(guò)雙脫氧鏈終止法（PCR-Sanger）測(cè)序檢測(cè)Hp并獲得耐藥基因23S rRNA與gyrA的突變情況，推斷出Hp對(duì)克拉霉素與左氧氟沙星的耐藥情況，從而選擇敏感抗生素進(jìn)行個(gè)體化治療，以期提高Hp的根除率。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年1至6月因各種消化道癥狀于溫州市中心醫(yī)院就診且13C尿素呼氣試驗(yàn)陽(yáng)性提示存在Hp感染的患者200例，依據(jù)“第五次全國(guó)幽門(mén)螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告”推薦[4]，所有患者均符合Hp根除治療指征。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～70歲，男女不限，均為初治患者；（2）因腹痛、腹脹、反酸、噯氣、惡心、嘔吐、燒心、胸痛、嘔血、黑便等各種不適癥狀就診；（3）4周內(nèi)未使用抗生素、鉍劑、H2受體拮抗劑或PPI制劑；（4）同意行胃鏡檢查取胃黏膜活檢組織標(biāo)本進(jìn)行Hp PCRSanger測(cè)序、細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)；（5）同意進(jìn)行Hp根除治療，并愿意配合醫(yī)生進(jìn)行根除療效的隨訪調(diào)查。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；（2）妊娠或哺乳期婦女；（3）有上消化道活動(dòng)性出血、穿孔、幽門(mén)梗阻、癌癥并發(fā)癥者；（4）有食管、胃腸手術(shù)史者；（5）患者不能正確表達(dá)自己的主訴，如精神病、嚴(yán)重神經(jīng)官能癥者；（6）同時(shí)服用非甾體抗炎藥或酗酒者；（7）對(duì)阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、呋喃唑酮等4種抗生素任一種過(guò)敏者。將所有患者按隨機(jī)數(shù)字表法分為個(gè)體化治療組與經(jīng)驗(yàn)治療組兩組，每組100例。本研究經(jīng)溫州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 標(biāo)本采集 常規(guī)胃鏡檢查后選擇胃竇小彎側(cè)距幽門(mén)5 cm內(nèi)的黏膜深部組織，在相近部位（1 cm以?xún)?nèi)）取3塊胃黏膜組織，分別用于Hp PCR-Sanger測(cè)序、細(xì)菌培養(yǎng)及組織病理學(xué)檢查。

1.3 Hp檢測(cè)方法

1.3.113C尿素呼氣試驗(yàn) 空腹或禁食2 h以上的患者正常吹氣至氣袋飽滿(mǎn)（0 min呼氣）；之后，徹底漱口并服用13C尿素顆粒，靜坐30 min再次收集氣體（30 min呼氣）；分別對(duì)兩次呼氣的13CO2進(jìn)行檢測(cè)，并依據(jù)兩次檢測(cè)值差值判定患者呼氣試驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)值≥4.0判定為陽(yáng)性，＜4.0判定為陰性。

1.3.2 PCR-Sanger測(cè)序 （1）全基因組提取：將胃黏膜組織研磨后采用美國(guó)Life Technologies公司的Invitrogen Purelink Genomic DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行人和細(xì)菌的全基因組提取，12 000 r/min離心3 min，去除上清液，加入專(zhuān)用裂解液和鋼珠進(jìn)行細(xì)胞破碎，隨后95℃金屬浴10 min，結(jié)束后立即放入4℃冰箱冷卻30 min，最后12 000 r/min離心10 min，吸出上清液即為全基因組，提取到Hp全基因組斷定為陽(yáng)性，否則判定為陰性。（2）耐藥基因擴(kuò)增：使用23S rRNA和gyrA基因引物（表1）對(duì)耐藥基因23S rRNA和gyrA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（3）Sanger測(cè)序：使用3730XL測(cè)序儀對(duì)23S rRNA和gyrA基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。（4）耐藥基因測(cè)序結(jié)果分析：采用chromas和Sequencing Analysis5.2軟件進(jìn)行序列分析，得出Sanger測(cè)序峰圖，對(duì)每個(gè)樣本的23S rRNA（A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C），gyrA（Asn87Lys、Ala88Val、Asp91Gly/Asn/Ala/Tyr）突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，給出耐藥性，突變判定為耐藥，未突變判定為敏感（圖1-4，插頁(yè)）。

圖1 克拉霉素未突變株測(cè)序圖

圖2 克拉霉素A2143G純合突變株測(cè)序圖

圖3 喹諾酮類(lèi)81位未突變、Asn91位未突變株測(cè)序圖

圖4 喹諾酮類(lèi)Asn87Lys雜合突變、91位未突變株測(cè)序圖

1.3.3 細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn) （1）Hp分離培養(yǎng)：胃黏膜組織經(jīng)充分研磨后，接種于哥倫比亞血瓊脂平板（5%脫纖維綿羊血），37 ℃三氣培養(yǎng)箱中（5% O2、10% CO2、85% N2）微需氧環(huán)境下培養(yǎng) 96 h；（2）Hp鑒定：可疑菌落經(jīng)肉眼觀察、革蘭染色鏡檢、尿素酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶試驗(yàn)陽(yáng)性者，為Hp菌株，判定為陽(yáng)性，否則判定為陰性。（3）Hp藥敏試驗(yàn)：根據(jù)美國(guó)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦方法，采用耐藥臨界點(diǎn)藥物瓊脂稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將抗生素溶液加入瓊脂中稀釋成相應(yīng)的臨界點(diǎn)濃度，傾注平板，接種菌懸液，若接種點(diǎn)有菌生長(zhǎng)則該菌株判定為耐藥，否則判定為敏感。

表1 耐藥基因測(cè)序引物序列

1.4 分組處理 個(gè)體化治療組所有患者均予行胃鏡檢查及病理活檢，并同時(shí)行Hp PCR-Sanger測(cè)序、細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，對(duì)比分析測(cè)序法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)Hp的陽(yáng)性率及藥敏結(jié)果；測(cè)序陽(yáng)性患者予測(cè)序方案治療（抗生素選擇阿莫西林+克拉霉素與左氧氟沙星中任一敏感者，如均耐藥，則選擇呋喃唑酮），即艾司奧美拉唑腸溶片（耐信片：中國(guó)阿斯利康制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20046379，20 mg/7 片/盒）1 片/次，2 次/d＋膠體果膠鉍膠囊（膠體果鉍膠囊：山西振東安特生物制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20058476，100 mg/48 片/盒）2 片/次，2次/d＋阿莫西林膠囊（阿莫仙：珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H44021351，250 mg/24 片/盒）4 片/次，2次/d＋克拉霉素緩釋片（諾邦：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20031041，500 mg/3 片/盒）1片/次，2次/d或左氧氟沙星片（可樂(lè)必妥：北京第一三共制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20040091，500 mg/4 片/盒）1 片/次，1 次/d或呋喃唑酮片（痢特靈：上海金不換蘭考制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H41021628，100 mg/100 片/瓶）1 片/次，2 次/d。經(jīng)驗(yàn)治療組患者未行PCR-Sanger測(cè)序，其余檢測(cè)方法相同，給予經(jīng)驗(yàn)方案治療，即艾司奧美拉唑腸溶片1片/次，2次/d＋膠體果膠鉍膠囊2片/次，2次/d＋阿莫西林膠囊4 片/次，2次/d＋克拉霉素緩釋片 1片/次，2次/d。兩組患者療程均為14 d，停藥后4～8周后復(fù)查13C呼氣試驗(yàn)確定Hp是否已根除成功。治療過(guò)程中對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，記錄患者的基本信息、檢查結(jié)果、用藥情況、藥物不良反應(yīng)及Hp根除治療結(jié)果，對(duì)比分析兩組患者的Hp根除率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用意向性分析（ITT）與遵循研究方案分析（PP）評(píng)價(jià)療效；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kappa檢驗(yàn)對(duì)個(gè)體化治療組PCR-Sanger測(cè)序與藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行一致性分析；Kappa值≥0.75說(shuō)明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好；0.4≤Kappa值＜0.75說(shuō)明兩種方法診斷結(jié)果一致性一般；Kappa值＜0.4說(shuō)明兩種方法診斷結(jié)果一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 個(gè)體化治療組患者Hp檢測(cè)結(jié)果分析 個(gè)體化治療組患者中男43 例，女 57 例，年齡 20～70（44.13±12.17）歲；胃鏡檢查及病理活檢結(jié)果顯示，個(gè)體化治療組均存在慢性胃炎，其中慢性活動(dòng)性胃炎81例，伴慢性萎縮性胃炎30例，伴胃或十二指腸潰瘍20例；PCR-Sanger測(cè)序法檢測(cè)Hp的陽(yáng)性率為80.00%（80/100），明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)法的44.00%（44/100），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中慢性活動(dòng)性胃炎患者的PCR-Sanger測(cè)序法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)Hp的陽(yáng)性率均明顯高于慢性非活動(dòng)性胃炎患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而在慢性萎縮性胃炎與慢性非萎縮性胃炎、伴胃十二指腸潰瘍與不伴胃十二指腸潰瘍的患者之間兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 個(gè)體化治療組Hp檢測(cè)結(jié)果分析（例）

另外，PCR-Sanger測(cè)序陽(yáng)性80株菌株的耐藥基因測(cè)序結(jié)果分析顯示，克拉霉素耐藥31例，耐藥率38.75%（31/80），左氧氟沙星耐藥34例，耐藥率42.50%（34/80）；細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性44株菌株的體外藥敏結(jié)果顯示，克拉霉素耐藥10例，耐藥率22.73%（10/44），左氧氟沙星耐藥12例，耐藥率27.27%（12/44）。細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性44例中僅1例測(cè)序陰性，即兩種檢測(cè)方法均陽(yáng)性43例。Kappa分析結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法對(duì)克拉霉素及左氧氟沙星藥敏情況診斷的一致性分析Kappa值分別為0.532及0.641，提示兩種檢測(cè)方法診斷結(jié)果的一致性一般，見(jiàn)表3。

2.2 兩組患者Hp根除治療情況分析 個(gè)體化治療組PCR-Sanger測(cè)序陽(yáng)性80例患者根據(jù)測(cè)序結(jié)果給予測(cè)序方案治療，測(cè)序陰性20例患者予經(jīng)驗(yàn)方案治療，但不納入治療階段研究，而經(jīng)驗(yàn)治療組100例患者均給予經(jīng)驗(yàn)方案治療，故共180例患者納入治療階段研究。其中男 80 例，女 100 例，年齡 20～70（46.19±12.08）歲。個(gè)體化治療組共有9例患者被剔除或失訪，其中因服用克拉霉素后出現(xiàn)心悸1例，口服呋喃唑酮后出現(xiàn)皮疹或惡心無(wú)法繼續(xù)治療2例，治療不規(guī)范或失訪6例；經(jīng)驗(yàn)治療組因治療不規(guī)范或失訪被剔除12例；兩組均有部分患者（個(gè)體化治療組12例，經(jīng)驗(yàn)治療組18例）服用克拉霉素后出現(xiàn)口苦，但均未出現(xiàn)無(wú)法繼續(xù)治療的嚴(yán)重不良反應(yīng)。最終，按PP，個(gè)體化治療組Hp根除率90.14%（64/71）明顯高于經(jīng)驗(yàn)治療組的77.27%（68/88），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；按ITT，個(gè)體化治療組Hp根除率80.00%（64/80）與經(jīng)驗(yàn)治療組的 68.00%（68/100）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 4。

表3 Hp PCR-Sanger測(cè)序與藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致性分析（例）

表4 兩組患者Hp根除治療結(jié)果分析（例）

3 討論

現(xiàn)在普遍認(rèn)為滿(mǎn)意的Hp根除治療方案的根除率應(yīng)達(dá)85%以上，且不引起嚴(yán)重的臨床不良反應(yīng)和細(xì)菌耐藥性。近年來(lái)，隨著Hp體外細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)在臨床上的廣泛開(kāi)展，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感抗生素進(jìn)行個(gè)體化治療越來(lái)越受到重視。大量研究顯示，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果制定的Hp根除治療方案可顯著提高根除率[5-6]。然而，由于受到標(biāo)本采集、保存、運(yùn)送、分離培養(yǎng)等多方面因素的影響，目前Hp體外培養(yǎng)的陽(yáng)性率并不高，有文獻(xiàn)報(bào)道醫(yī)院就診患者的培養(yǎng)陽(yáng)性率僅為34.17%（17 731/51 891）[7]，明顯低于 Hp 平均感染率（約 50%）[8]。這部分培養(yǎng)陰性的Hp感染患者只能采用經(jīng)驗(yàn)性方案進(jìn)行根除治療，導(dǎo)致根除率降低或出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，無(wú)法達(dá)到理想的治療效果。因此，想要提高這部分患者的Hp根除率，就需要一種靈敏度高且能檢測(cè)耐藥情況的檢測(cè)技術(shù)。

熒光PCR技術(shù)是一種直接檢測(cè)核酸的分子生物學(xué)技術(shù)，具有靈敏度、特異度高、操作簡(jiǎn)單、能夠早期檢測(cè)病原體的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于Hp的檢測(cè)[9]；PCRSanger測(cè)序法是目前應(yīng)用最多的核酸測(cè)序技術(shù)，具有高度的準(zhǔn)確性，是基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，目前已廣泛應(yīng)用于Hp的全基因組測(cè)序[10]。本研究結(jié)果顯示，PCR-Sanger測(cè)序法檢測(cè)Hp的陽(yáng)性率為80.00%，仍有20.00%的假陰性率，考慮可能與PCR-Sanger測(cè)序法只取1塊胃黏膜組織進(jìn)行基因提取與擴(kuò)增有關(guān)，但其陽(yáng)性率明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)法的44.00%，提示PCR-Sanger測(cè)序法相對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)法能顯著提高Hp檢測(cè)的靈敏度，彌補(bǔ)細(xì)菌培養(yǎng)法靈敏度不高的缺點(diǎn)，使培養(yǎng)陰性的Hp感染患者也可以通過(guò)PCR-Sanger測(cè)序法分析選擇敏感抗生素進(jìn)行個(gè)體化治療，從而提高Hp根除成功率。此外，目前臨床上應(yīng)用的細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)檢測(cè)的周期需要10 d，而PCR-Sanger測(cè)序法僅需3 d，可顯著提高檢測(cè)效率，從而提高患者的依從性，避免因檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的患者失訪或治療不規(guī)范。

一項(xiàng)納入12篇RCT研究的薈萃分析結(jié)果表明[11]，含鉍劑經(jīng)驗(yàn)四聯(lián)療法的根除率為77.6%，而含克拉霉素經(jīng)驗(yàn)三聯(lián)療法的根除率僅為68.9%，均無(wú)法達(dá)到滿(mǎn)意的根除治療效果。目前Hp根除治療失敗的原因主要是由于Hp對(duì)常用的抗生素耐藥[12]。近些年報(bào)道推薦用于Hp根除治療的6種抗生素中，甲硝唑耐藥率達(dá)到40%～70%，克拉霉素達(dá)到20%～50%，左氧氟沙星達(dá)到20%～50%，而阿莫西林、呋喃唑酮和四環(huán)素的耐藥率仍很低（1%～5%）[4]。其中，甲硝唑因耐藥率太高，呋喃唑酮與四環(huán)素因藥物不良反應(yīng)及安全性問(wèn)題，均已很少作為臨床一線使用；目前臨床上使用最多的抗生素是阿莫西林、克拉霉素及左氧氟沙星，因此Hp對(duì)左氧氟沙星與克拉霉素的耐藥情況與根除治療結(jié)果密切相關(guān)，如果能在治療前檢測(cè)出Hp對(duì)這兩種抗生素的耐藥情況，即可選擇敏感抗生素進(jìn)行根除治療。

本研究通過(guò)PCR-Sanger測(cè)序法得出Hp對(duì)克拉霉素與左氧氟沙星的耐藥情況，從而制定個(gè)體化方案進(jìn)行根除治療。結(jié)果顯示，個(gè)體化治療組Hp的根除率按PP達(dá)到90.14%（64/71），明顯高于經(jīng)驗(yàn)治療組的77.27%（68/88），提示根據(jù)Sanger測(cè)序結(jié)果的個(gè)體化治療方案可顯著提高Hp的根除率；而個(gè)體化治療組與經(jīng)驗(yàn)治療組的Hp根除率按ITT分別為80.00%（64/80）及68.00%（68/100），個(gè)體化治療組Hp根除率高于經(jīng)驗(yàn)治療組，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能與本研究的樣本量相對(duì)較少以及失訪率相對(duì)較高有關(guān)。同時(shí)，Kappa分析結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法對(duì)克拉霉素及左氧氟沙星藥敏情況診斷結(jié)果的一致性一般，提示診斷Hp耐藥情況的基因型與表型之間可能還是存在一定的差異，也可能與本研究的樣本量相對(duì)不足有關(guān)，有待后續(xù)的大樣本研究加以證實(shí)。

綜上所述，PCR-Sanger測(cè)序法檢測(cè)Hp不僅靈敏度高，且檢測(cè)周期短、效率高，同時(shí)能分析Hp對(duì)克拉霉素與左氧氟沙星的耐藥情況，從而制定個(gè)體化治療方案，能顯著提高Hp根除率。