石墨烯對生殖毒性的研究進(jìn)展

張靜，高玉，楊永秀，關(guān)徳鳳

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272113；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，蘭州 730000)

石墨烯以氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)、石墨烯量子點(diǎn)(Graphene quantum dots，GQDs)、單壁碳納米管(Single-walled carbon nanotube，SWCNT)等多種結(jié)構(gòu)形式存在。2004年，Konstantin等首次從石墨中分離出石墨烯，之后學(xué)者們圍繞石墨烯在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用展開了大量研究，包括藥物/基因傳遞、生物傳感和成像、抗菌材料、細(xì)胞培養(yǎng)的生物相容性支架等。此外石墨烯氧化物結(jié)合808 nm近紅外激光照射在癌癥化學(xué)光熱治療中具有巨大的潛力，已經(jīng)成為癌癥治療的新材料[1-2]。石墨烯尤其是GO對于各種生物體會有毒性作用。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯會在不同的組織和器官蓄積，并對血液循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和肝腎功能造成不同程度的危害[3]。原始和功能化的石墨烯納米材料(Graphene nanomaterials，GNMs)在實(shí)驗室哺乳動物中表現(xiàn)出潛在的肺毒性、系統(tǒng)性毒性、行為毒性、生殖毒性和發(fā)育毒性以及基因毒性[4]。體外實(shí)驗表明，細(xì)胞或組織暴露于過量的GNMs會激活過量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，從而影響細(xì)胞的代謝和呼吸，同時會有炎癥反應(yīng)的發(fā)生[3]，這可能是石墨烯的主要毒性機(jī)制。

一、石墨烯在生物器官中的蓄積

石墨烯顆?？梢杂泻芏噙M(jìn)入人體的途徑，如皮膚接觸、呼吸吸入、口腔黏膜以及眼結(jié)膜接觸等。Liang等[5]的研究表明，分別通過尾靜脈和腹部注射125I標(biāo)記的GO 到雄性小鼠體內(nèi)，從放射性水平來看，GO納米片主要分布在四個器官：肝臟、脾臟、肺和腎；小鼠尾靜脈注射后四個器官的GO濃度均顯著高于腹部注射后四個器官的GO濃度。此外，GNMs會在生殖器官中蓄積，研究者在雄性小鼠體內(nèi)注射5 mg/kg的功能化石墨烯后，雖然小鼠在體重、睪丸以及附睪的重量上均未發(fā)生明顯變化，但是他們發(fā)現(xiàn)在處理10 min、60 min和24 h時睪丸中分別積累了41、61和151 ng的GNMs[6]。

目前對于石墨烯材料在生物器官的蓄積情況，實(shí)驗者只發(fā)現(xiàn)該材料存在于肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中，還需要更多的實(shí)驗來探索石墨烯在其他生物器官的蓄積情況。

二、石墨烯的生殖毒性

1.體外實(shí)驗：體外實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯對于生殖細(xì)胞有一定的毒性，并且它的毒性作用存在一定的劑量依賴性，這與石墨烯的理化特性密切相關(guān)。GQDs的暴露使得昆明小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過程中未能排出第一個極體，導(dǎo)致第一次極體排出失敗[7]。眾所周知，卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂主要依賴于卵母細(xì)胞骨架組織肌動蛋白帽的動態(tài)變化，這一變化在時間和空間上受到高度調(diào)控，同時在卵母細(xì)胞成熟過程中，紡錘體處于不對稱位置是極體排出成功的關(guān)鍵[8-11]。研究者發(fā)現(xiàn)，GQDs暴露的小鼠卵母細(xì)胞成熟過程中紡錘體遷移和肌動蛋白帽形成失敗，可能導(dǎo)致第一次極體排出失敗[12]，從而影響卵母細(xì)胞的體外成熟；此外另有研究者發(fā)現(xiàn)，GQDs會阻斷小鼠精母細(xì)胞系(GC-2)和正常小鼠睪丸Sertoli細(xì)胞(TM4)自噬通量[13]，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[12]，可能對男性生殖有潛在的危害。GNMs的毒性取決于劑量、暴露時間、細(xì)胞類型和聚集程度等多種因素[14]。有文獻(xiàn)報道，反復(fù)接觸GNMs對于小鼠的睪丸會產(chǎn)生可逆性的損傷，但是對精子體外活力并沒有很大的影響，并不影響生育能力[6]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的GO可導(dǎo)致睪丸組織的損傷，包括生精小管萎縮、生發(fā)上皮細(xì)胞減少、生殖細(xì)胞丟失和空泡化[14]，由此影響精子活性。

Asghar等[15]的研究首次就還原GO對人類精子的毒性進(jìn)行了初步評估，精子暴露于GO可能導(dǎo)致精子活力發(fā)生變化，但是根據(jù)世界衛(wèi)生組織對精子運(yùn)動性的評估標(biāo)準(zhǔn)，這種影響不會對人精子造成明顯的傷害，然而孵育于還原性GO的精子會產(chǎn)生ROS，由于ROS的存在，精子的運(yùn)動速度和氧化應(yīng)激發(fā)生了明顯的變化。氧化應(yīng)激物質(zhì)在濃度較高的情況下可能對男性生育能力產(chǎn)生不利影響。

上述結(jié)果表明，GNMs的暴露會導(dǎo)致哺乳動物生殖細(xì)胞的體外發(fā)育出現(xiàn)明顯異常，極有可能影響生育功能。

2.體內(nèi)實(shí)驗：體內(nèi)實(shí)驗研究表明，石墨烯對于生殖功能有一定的影響，具體作用不盡相同。在交配前或妊娠早期給雌性小鼠注射GO，未見明顯的生殖毒性，但是在臨產(chǎn)期前注射高劑量的GO會出現(xiàn)死產(chǎn)和流產(chǎn)現(xiàn)象[16]；在哺乳期間，母體含GO，水的攝入量減少，可能會減少乳汁的分泌，從而影響后代的生長發(fā)育[17]。

Wistar大鼠腹腔暴露于3種劑量GO，即低劑量(0.4 mg/kg)、中劑量(2.0 mg/kg)和高劑量(10.0 mg/kg)，重復(fù)暴露15 d和30 d的大鼠附睪精子計數(shù)下降和異常精子增多，活動精子的百分比也因暴露而顯著降低[14]。向性成熟雄性小鼠氣管內(nèi)灌注四種分散在納米水中的GNMs，研究GNMs對肺炎后精子質(zhì)量的影響，最后一次灌注后一周，暴露于納米顆粒組的小鼠支氣管肺泡液中性粒細(xì)胞顯示持續(xù)的炎癥反應(yīng)，但是附睪精子參數(shù)、日精子產(chǎn)量和血漿睪酮水平均無顯著變化[18]。通過灌胃或靜脈注射，研究發(fā)現(xiàn)GQDs對雄性小鼠的性行為頻率和時間沒有影響，GQDs暴露的雄性小鼠睪丸和附睪的結(jié)構(gòu)和功能、生殖生理(如健康精子的產(chǎn)生和儲存、睪丸中正常的總蛋白和關(guān)鍵酶濃度的維持)也無明顯影響，睪酮水平也保持正常，暴露于GQDs的雄鼠與雌鼠交配后第一、第二和隨后一窩的幼鼠都健康[19]。總之，只有有限的資料表明，靜脈注射還原GO和口服GO可能引起在體生殖毒性，但是在實(shí)際環(huán)境中，吸入石墨烯顆粒為石墨烯進(jìn)入人體的主要方式，并且體外實(shí)驗表明石墨烯對生殖細(xì)胞有一定的毒性，所以需要更多入體途徑的研究來了解石墨烯的生殖毒性。

對其他模式生物的研究發(fā)現(xiàn)，除了哺乳動物，石墨烯對包括魚類、線蟲、水蚤和蟋蟀在內(nèi)的多種生物的繁殖均有影響，并且對后代產(chǎn)生影響。兩代蟋蟀長期暴露于食物中的GO，接受GO處理的兩組蟋蟀的生殖能力都明顯低于對照組[20]；GO可在斑馬魚幼蟲的眼睛、心臟、卵黃囊和血管中積累累積[21]；Manjunatha等首次闡明了不同濃度原始石墨烯可導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟發(fā)育不全及其特定的心血管缺陷[22]，高濃度的GO(0.41 mg/ml)會導(dǎo)致顯著的胚胎死亡率升高[23]；Kim等[24]研究發(fā)現(xiàn)GO會在秀麗隱桿線蟲生殖器官中的累積，對精子形成抑制以及改變脂肪酸代謝從而對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生生殖毒性損害。

三、石墨烯的毒性作用機(jī)制

納米材料的性能和毒性與其物理和化學(xué)特性有關(guān)，如顆粒大小、結(jié)構(gòu)、形狀、表面積、表面電荷、溶解度、催化活性、表面涂層和表面活性基團(tuán)等[21，25]。小尺寸的GNMs允許它們穿過細(xì)胞膜和其他生物屏障進(jìn)入生物體，造成細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯的表面積與氧化電位呈正相關(guān)，體積更小、表面積更大的石墨烯對大鼠的氧化應(yīng)激和DNA損傷表現(xiàn)出更高的功效[26]。ROS的產(chǎn)生是納米材料最重要的毒性機(jī)制之一，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥、脂質(zhì)過氧化，并造成蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和DNA的損傷[27]。

不同的研究報道了GO介導(dǎo)不同類型細(xì)胞自噬和壞死相關(guān)的多種信號通路的激活[28]；表觀遺傳調(diào)控機(jī)制包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色體重塑和小RNA調(diào)控已被報道可誘導(dǎo)納米毒性。在Sun等[27]的一項研究中，研究人員利用體外腎細(xì)胞系(HEK-293T)評估了GO使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的納米毒性，結(jié)果顯示其毒性的主要作用機(jī)制為激活了COX-2的高表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，破壞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。此外，在生殖細(xì)胞的研究中顯示，GNMs可以降低組織蛋白酶的數(shù)量和酶活性，抑制溶酶體蛋白水解能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；影響肌動蛋白帽的形成和第一極體排出，引起相關(guān)卵母細(xì)胞無法減數(shù)分裂，進(jìn)而影響生殖活性[7，13]。

四、總結(jié)與展望

石墨烯是目前職業(yè)暴露較為廣泛的納米材料之一，由于其優(yōu)異的理化特性而有廣泛的應(yīng)用前景。研究表明，石墨烯通過不同的途徑進(jìn)入生物體后，可以在生殖器官或組織中蓄積，引起各種組織生物損害，目前對石墨烯透過這類生物屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的了解比較少。體外實(shí)驗表明，石墨烯暴露可以誘發(fā)生殖細(xì)胞的損傷；石墨烯在生殖細(xì)胞及組織內(nèi)的蓄積和毒性與其粒徑、表面涂層、接觸的濃度和時間等因素相關(guān)；目前只有少數(shù)體內(nèi)實(shí)驗研究表明石墨烯對小鼠生殖系統(tǒng)有影響，可能與石墨烯入體途徑有關(guān)，有待進(jìn)一步研究?，F(xiàn)有的資料表明，誘發(fā)細(xì)胞或組織內(nèi) ROS水平的升高是石墨烯造成細(xì)胞或系統(tǒng)毒性的主要原因。由于石墨烯的應(yīng)用前景和潛在毒性，應(yīng)該增多對石墨烯的生殖毒性研究，深入了解其在生殖系統(tǒng)的分布蓄積及其通過血睪屏障、胎盤屏障等生物屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，同時進(jìn)一步研究其對生殖系統(tǒng)的影響和毒性作用機(jī)制，為石墨烯生物醫(yī)用提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。