內(nèi)消軟脈湯對ApoE-/-小鼠解耦聯(lián)蛋白1依賴性脂解通路、血脂及高敏C反應(yīng)蛋白的影響

王可彬 李賀 吳圣賢

心腦血管疾病是威脅人類生命健康的重要原因[1-2]，高脂血癥及代謝性炎癥在許多心腦血管病發(fā)生及發(fā)展的過程中起到重要作用。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對高脂血癥的主要治療措施是強(qiáng)化降脂治療，如長期服用他汀類藥物，但其具有一定的肝毒性及腎毒性[3]，且沒有針對性降低血管內(nèi)代謝性炎癥的藥物，而中醫(yī)藥治療高脂血癥及代謝性炎癥具有顯著的療效并且副作用較小。本課題組結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，提出了“脈生痰核”的理論[4-5]，創(chuàng)立了“內(nèi)消軟脈湯”用于治療頸動脈粥樣硬化，已取得顯著臨床療效，通過觀察臨床患者的治療效果以及進(jìn)一步的探究，發(fā)現(xiàn)“內(nèi)消軟脈湯”可以降低患者的血脂及炎癥水平。因“內(nèi)消軟脈湯”屬于“化痰散結(jié)”類方劑，源于中醫(yī)外科治療“頸生痰核、臂生痰核”的方藥，故認(rèn)為其作用部位在皮下。而大量研究表明，皮下脂肪的活化可顯著遏制動脈粥樣硬化發(fā)展并且穩(wěn)定易損斑塊[6]，究其作用機(jī)制主要也是抑制代謝性炎癥[7]以及降低甘油三酯和膽固醇水平[6-8]，因此推測，“內(nèi)消軟脈湯”可以抑制代謝性炎癥、降低甘油三酯和膽固醇水平，且這些功效是通過激活皮下脂肪活化來實現(xiàn)的，而皮下脂肪的激活嚴(yán)格依賴解耦聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)[9-10]，為驗證“內(nèi)消軟脈湯”是否抑制代謝性炎癥及降低血脂水平，并探究此作用的實現(xiàn)是否與激活UCP1依賴性脂解有關(guān)，進(jìn)行了以下實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用7周齡雄性ApoE-/-小鼠48只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK：(京)016-0006。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院教育部重點學(xué)科實驗室動物實驗中心，室溫22℃，濕度45～55%，12 h/12 h：光照/黑夜循環(huán)，自由進(jìn)食水。

1.2 實驗藥物與試劑

“內(nèi)消軟脈湯”由陳皮9 g、茯苓9 g、姜半夏9 g、白僵蠶9 g、玄參9 g、生牡蠣9 g、海藻9 g、昆布9 g、炮山甲3 g、皂刺3 g、浙貝母9 g、天花粉9 g、夏枯草9 g、橘核9 g、醋鱉甲9 g、姜黃9 g、丹參9 g、當(dāng)歸6 g、制乳香3 g、制沒藥3 g、炒白芥子6 g、白芷6 g、薄荷6 g、香附6 g、生黃芪9 g、靈芝9 g、金銀花9 g、黃連9 g組成，所有藥材購自北京康仁堂公司。4%多聚甲醛溶液(4%，PFA)，貨號：SS0312；中性快干膠，購自中杉金橋公司，貨號：ZLI-9516；兔抗GADPH抗體，購自PTG公司；山羊抗兔二抗試劑，購自北京普利萊公司，貨號：P1003；兔抗UCP1抗體，購自abcam公司，貨號：ab10983；5×蛋白上樣緩沖液，購自普利萊公司，貨號：B1012；BCA蛋白定量試劑盒BCA Reagent，購自普利萊公司，貨號：P1511；RIPA裂解液，貨號：C1053，購自普利萊公司；蛋白酶抑制，購自普利萊公司；SDS，購自普利萊公司；吐溫-20，購自普利萊公司，貨號：A1007；封閉專用脫脂奶粉，購自普利萊公司，貨號：P1622；預(yù)染色蛋白Maker，購自普利萊公司，貨號P1103；發(fā)光液，購自碧云天公司。

1.3 動物分組與造模[11]

48只ApoE-/-小鼠采用隨機(jī)數(shù)表法分為空白組、模型組、“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組、“內(nèi)消軟脈湯”高劑量組，每組12只。各組小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除空白組給予正常飲食外，其余三組給予高脂飲食(21%脂肪+0.15%膽固醇)，持續(xù)60日，造模過程中無小鼠死亡。鑒于環(huán)境溫度對脂解作用有明顯影響，本研究采用環(huán)境動物飼養(yǎng)箱，全程控制并恒定飼養(yǎng)溫度為22°C。鑒于脂解過程中消耗熱量，會明顯增加小鼠食量，本研究將各組動物匹配飼養(yǎng)。

1.4 給藥

造模結(jié)束后第2天開始灌胃給藥，每天一次，連續(xù)60天?？瞻捉M和模型組予0.9%生理鹽水0.3 mL灌胃；“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組予“內(nèi)消軟脈湯”混懸液68 mg/kg/d灌胃；“內(nèi)消軟脈湯”高劑量組予“內(nèi)消軟脈湯”混懸液102 mg/kg/d灌胃，每只小鼠的給藥體積為0.3 mL/d，其中低劑量組為臨床等效劑量，連續(xù)給藥56天，“內(nèi)消軟脈湯”高劑量組小鼠在藥物干預(yù)過程中死亡1只。

1.5 標(biāo)本采集處理過程

在給藥60天后對各組小鼠(除“內(nèi)消軟脈湯”高劑量組11只外，其余組12只)進(jìn)行取材，需要采集的樣本有：血清，肩胛區(qū)棕色脂肪組織、腹股溝皮下白色脂肪組織、附睪內(nèi)臟白色脂肪組織。處死小鼠前禁食水8小時。使用眼球取血法采血，剪去小鼠嘴邊須毛，左手捏住頸后肌肉，保持頭低腳高位，固定小鼠頭部，右手持彎鑷快速夾除一側(cè)眼球，采血于1.5 mL離心管內(nèi)，每只小鼠采血(200～300)μL血液，取血結(jié)束后，靜置，血樣待出現(xiàn)分層后，以3000 rpm×15 min的參數(shù)進(jìn)行離心，取上層血清，凍存于-80℃冰箱，于協(xié)和醫(yī)院檢驗科以生化法檢測血脂和高敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitive C-reactive protein,HS-CRP)。采血完畢后，把小鼠浸泡于75%酒精中充分消毒并固定于自制小鼠手術(shù)臺，后采集小鼠肩胛兩側(cè)棕色脂肪組織、腹股溝皮下白色脂肪組織、附睪內(nèi)臟白色脂肪組織。分別將一側(cè)脂肪組織放入凍存管內(nèi)并立即放置于液氮中保存以備Western blot法檢測；另一側(cè)脂肪組織保存于4%多聚甲醛中以備HE染色。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 生化法檢測各組小鼠血清TG、LDL、HS-CRP 以上指標(biāo)均由北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科檢測。

1.6.2 HE染色觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)及大小 對各組小鼠的肩胛、腹股溝和附睪區(qū)脂肪組織(n=3)的石蠟切片進(jìn)行HE染色，使用高倍顯微鏡拍攝幾個連續(xù)的切片照片，觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)及大小來驗證脂肪組織的褐變情況。

1.6.3 Western blot法檢測UCP1在肩胛區(qū)、腹股溝處、附睪區(qū)的蛋白表達(dá)量 將組織用RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑(50∶1)充分消化，制成乳糜顆粒，然后在4℃冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5424/5424R)中于12000 G離心10分鐘。用SDS-PAGE上樣緩沖液(1∶5，APPLYGEN)稀釋液體上清液中的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至沸水中，然后-20℃保存。通過依次用6%+10%SDS-PAGE在60V下離心30分鐘分離加工的蛋白質(zhì)，然后在100 V上調(diào)電壓下離心1小時，然后在300 mA的硝酸纖維素膜(APPLYGEN)上轉(zhuǎn)移1.5小時。轉(zhuǎn)移后，將膜在3%～5%的脫脂干奶中于常溫下封閉1小時。將膜與針對UCP1的一抗(1∶1000，abcam)在4℃孵育過夜，并用TBST洗滌，然后在室溫下與適當(dāng)?shù)亩?ZSGB-BIO)孵育1小時。最終，使用輕質(zhì)液體(BeyoECL星，BEYOTIME)通過化學(xué)發(fā)光檢測目標(biāo)蛋白，并通過內(nèi)部參照GADPH(1∶5000，abcam)將其標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 “內(nèi)消軟脈湯”對小鼠血脂水平及炎性因子的影響

與空白組比較，模型組的HS-CRP、TG、LDL水平未見明顯差異。與模型組比較，“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組、“內(nèi)消軟脈湯”高劑量組的HS-CRP、TG水平均下降，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且HS-CRP在“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組下降程度更明顯。同時，與模型組比較，“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組的LDL也呈降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組ApoE-/-小鼠血清中HS-CRP、TG、LDL水平的比較

2.2 “內(nèi)消軟脈湯”對小鼠脂肪細(xì)胞棕色化的影響

2.2.1 ApoE-/-小鼠肩胛區(qū)脂肪細(xì)胞HE染色 “內(nèi)消軟脈湯”低劑量組、“內(nèi)消軟脈湯”高劑量組小鼠的肩胛脂肪具有細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞數(shù)目增多、細(xì)胞HE染色較深等棕色脂肪細(xì)胞的表現(xiàn)，且這種表現(xiàn)隨著“內(nèi)消軟脈湯”劑量增加而更加明顯。結(jié)果如圖1所示。

2.2.2 ApoE-/-小鼠腹股溝處脂肪細(xì)胞組織HE染色 空白組、模型組、“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組、“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組高劑量組的脂肪細(xì)胞體積逐漸變小、表現(xiàn)為分隔增多的多房室結(jié)構(gòu)脂泡、HE染色逐漸變深、細(xì)胞核著色逐漸增多，高倍顯微鏡下單位視野見脂肪細(xì)胞數(shù)目逐漸增多。結(jié)果如圖2所示。

2.2.3 ApoE-/-小鼠附睪區(qū)HE染色 空白組、模型組、“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組、“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組小鼠的附睪區(qū)脂肪的細(xì)胞體積、細(xì)胞數(shù)目未見顯著差異。結(jié)果如圖3所示。

2.3 “內(nèi)消軟脈湯”對ApoE-/-小鼠肩胛區(qū)、腹股溝區(qū)及附睪區(qū)UCP1蛋白表達(dá)的影響

用Western blot法對ApoE-/-小鼠肩胛區(qū)、腹股溝區(qū)及附睪區(qū)的UCP1蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測。模型組、“內(nèi)消軟脈湯”低劑量組、“內(nèi)消軟脈湯”高劑量組的肩胛區(qū)、腹股溝區(qū)的UCP1蛋白表達(dá)量依次增加。ApoE-/-小鼠肩胛區(qū)、腹股溝區(qū)及附睪區(qū)UCP1蛋白在模型組的表達(dá)量與空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ApoE-/-小鼠肩胛區(qū)、腹股溝區(qū)及附睪區(qū)UCP1蛋白的表達(dá)量與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2，圖4、圖5、圖6。

表2 各組ApoE-/-小鼠肩胛區(qū)、腹股溝區(qū)及附睪區(qū)UCP1蛋白表達(dá)的比較

注：A.空白組；B.模型組；C.內(nèi)消軟脈湯低劑量組；D.內(nèi)消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內(nèi)消軟脈湯低劑量組；D.內(nèi)消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內(nèi)消軟脈湯低劑量組；D.內(nèi)消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內(nèi)消軟脈湯低劑量組；D.內(nèi)消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內(nèi)消軟脈湯低劑量組；D.內(nèi)消軟脈湯高劑量組。

注：A.空白組；B.模型組；C.內(nèi)消軟脈湯低劑量組；D.內(nèi)消軟脈湯高劑量組。

3 討論

實驗結(jié)果表明，“內(nèi)消軟脈湯”可以降低ApoE-/-小鼠甘油三酯水平，并使ApoE-/-小鼠的肩胛區(qū)、腹股溝區(qū)及附睪區(qū)的脂肪組織活化增加，說明“內(nèi)消軟脈湯”可以激活棕色脂肪組織，并可以使白色皮下及內(nèi)臟脂肪組織棕色化，其中白色內(nèi)臟脂肪組織(附睪區(qū)脂肪組織)棕色化的程度小于白色皮下脂肪組織(腹股溝區(qū)脂肪組織)。根據(jù)實驗結(jié)果，小鼠脂肪組織UCP1的表達(dá)隨“內(nèi)消軟脈湯”劑量的增加而具有增加趨勢，說明此方可激活UCP1依賴性皮下脂肪活化。

小鼠TG及炎癥水平的降低可能均與脂肪組織活化有關(guān)。既往研究表明，當(dāng)脂肪組織活化時，腺苷酸環(huán)化為cAMP，激活cAMP依賴蛋白激酶，促進(jìn)激素敏感性甘油三酯脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)和細(xì)胞質(zhì)中脂滴包被蛋白1的磷酸化，后者激活脂肪組織內(nèi)甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)，最終在這些酶的作用下，甘油三酯分解為甘油及脂肪酸[12]，脂肪酸可出細(xì)胞并由血漿清蛋白運輸至全身利用，而存在于胞內(nèi)的脂肪酸則可進(jìn)一步激活UCP1的活性以促進(jìn)后期UCP1介導(dǎo)的產(chǎn)熱作用。棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)富含脂肪酸結(jié)合蛋白3(fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3)，甘油三酯分解產(chǎn)生胞內(nèi)脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與FABP3結(jié)合被轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)部[13]，進(jìn)行脂肪酸的β氧化，棕色脂肪細(xì)胞線粒體內(nèi)富含UCP1，可在線粒體內(nèi)膜上形成質(zhì)子通道，使內(nèi)膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的氫質(zhì)子直接由此通道返回線粒體基質(zhì)，由于影響了原本氫離子電化學(xué)梯度回流而促使釋放勢能的過程，從而使得氧化與磷酸化解偶聯(lián)，最終不產(chǎn)生ATP而由熱能直接釋放[14-15]，減少了脂類物質(zhì)的儲存，棕色脂肪組織活化產(chǎn)熱嚴(yán)格依賴于UCP1[16]，故UCP1是控制肥胖的重要靶點，可使得脂肪活化小鼠的TG水平得以下降。小鼠膽固醇水平的降低機(jī)制可能于棕色脂肪細(xì)胞活化后提升了膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白活性，使富含TG的脂蛋白代謝后的殘粒向高密度脂蛋白轉(zhuǎn)移增加，從而使膽固醇逆向轉(zhuǎn)運途徑效率增加有關(guān)[17]；還可能于產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞膜活化后，脂肪細(xì)胞數(shù)量增加，使機(jī)體利用膽固醇合成細(xì)胞膜增加有關(guān)，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

有研究證據(jù)表明，棕色脂肪組織的活化產(chǎn)熱嚴(yán)格依賴UCP1[12]，另外，激活白色脂肪組織可使之轉(zhuǎn)化成棕色樣脂肪組織，或稱為米色脂肪(beige)激活，從而發(fā)揮產(chǎn)熱作用，這一過程同樣也依賴UCP1[13]。由此可見，UCP1的激活機(jī)制是調(diào)控脂肪組織代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是研究新型降脂藥物的重要靶點。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血脂異常的表現(xiàn)多與“痰”相關(guān)[18]，過食肥甘厚味損傷脾運而生痰，或素體脾虛，脾失健運，致痰蘊體內(nèi)，痰濕體質(zhì)是體內(nèi)膏脂偏多[19]，是代謝紊亂性疾病如脂質(zhì)代謝異常發(fā)生的重要生理病理基礎(chǔ)，運用化痰法可改善血脂異常的狀態(tài)，“內(nèi)消軟脈湯”以二陳湯之陳皮、茯苓、姜半夏燥濕健脾化痰；以白僵蠶、浙貝母、海藻、昆布、橘核、炒白芥子化痰散結(jié)，又兼生黃芪、靈芝以健脾益氣，扶助正氣，助脾胃運化，以絕生痰之源，可通過多方面改善人體血脂異常的狀態(tài)。“炎癥”的成因與性質(zhì)與中醫(yī)學(xué)中“毒邪”的理論頗為相似，許多研究表明，具有清熱解毒作用的單味中藥及中藥復(fù)方均可抑制炎癥[20]，“內(nèi)消軟脈湯”中以天花粉、夏枯草、玄參、金銀花、黃連清熱解毒，結(jié)合白芷、香附、薄荷，配和僵蠶可升陽中之清陽；姜黃可降陰中之濁陰，一升一降，可以暢通身體內(nèi)外之氣機(jī)，可使雜氣之流毒頓消。

高脂血癥及代謝性炎癥對人體健康危害極大，中醫(yī)藥對于這類疾病的治療具有獨特的優(yōu)勢，目前，對于“化痰散結(jié)法”的研究已有不少，但對于其具體作用機(jī)制的研究不足，“內(nèi)消軟脈湯”作為“化痰散結(jié)法”典型方劑，若能明確其作用機(jī)制，將會對于開拓中醫(yī)藥治療心腦血管的新思路，尋找中醫(yī)藥防治高脂血癥及代謝性炎癥的新靶點，繼而進(jìn)一步提高臨床療效，具有重要意義。