探討防風(fēng)通圣散對多囊卵巢綜合征大鼠血清激素及卵巢組織學(xué)影響

林青 李以良 王夢雨

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種發(fā)病多因、臨床表現(xiàn)多態(tài)的綜合征，是以卵巢多囊性改變、高雄激素血癥和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)/促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)比值增高[1]為主要臨床表現(xiàn)的生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病[2]。育齡期婦女患病率達到 5%～8%[3]。PCOS的臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，其病理生理也較為復(fù)雜，除對生活質(zhì)量產(chǎn)生不利影響外，還易出現(xiàn)不孕癥、高胰島素血癥及心血管疾病等并發(fā)癥[4]。根據(jù)其癥狀，中醫(yī)學(xué)可歸于“月經(jīng)后期” “崩漏” “閉經(jīng)” “不孕”等病證范疇。多囊卵巢綜合征病因病機為腎、肝、脾 三臟功能失調(diào)，受痰濕、瘀血等病理產(chǎn)物侵襲，兩者互為因果作用于機體，使腎—天癸—沖任—胞宮軸功能紊亂而致。證屬本虛標實、虛實夾雜。針對于多數(shù)PCOS患者月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、肥胖、痤瘡等癥狀，部分現(xiàn)代學(xué)者提出，防風(fēng)通圣散或可以應(yīng)用于此病的臨床治療中。

有研究人員[5]將PCOS按體質(zhì)分有防風(fēng)通圣散體質(zhì)和五積散體質(zhì)，其中大多屬防風(fēng)通圣散體質(zhì)。其典型體質(zhì)表現(xiàn)為：體格壯實或肥胖，面色紅多油膩，皮膚干燥、粗糙，好發(fā)痤瘡，食欲好，便秘，唇紅或黯紅，月經(jīng)偏少，甚至閉經(jīng)。并通過臨床實踐表明，防風(fēng)通圣散對實熱型肥胖體質(zhì)患者，可改善高雄激素、高LH及高胰島血癥或胰島素抵抗的內(nèi)分泌狀態(tài)，以達到促進排卵的作用。有學(xué)者提出[6]治療痰濕閉經(jīng)應(yīng)主要從減肥、通經(jīng)、調(diào)周期方面入手，認為痰濁脂肪蘊塞，大便秘結(jié)之肥胖，當(dāng)給予防風(fēng)通圣丸治療，以達到表里雙解、通腑泄熱的目的。日本學(xué)者原桃介[7]應(yīng)用防風(fēng)通圣散治療肥胖癥患者，平均體重減輕10%，認為其具有加速新陳代謝產(chǎn)物排泄，提高脂肪代謝的功效,并推斷該方減肥機制可能在于分解脂肪,但其對蛋白質(zhì)代謝的影響不明顯。李聯(lián)甫[8]報道有學(xué)者以防風(fēng)通圣散及防己黃芪湯治療本病，經(jīng)治后體重減輕，膽固醇、甘油三酯下降明顯，研究指出防風(fēng)通圣散適用于結(jié)實型肥胖。日本學(xué)者宮本尚[9]于兩餐間和間歇給藥,并用防己黃芪湯及防風(fēng)通圣散治療肥胖癥患者6個月，病人平均體重指數(shù)明顯下降，食欲下降，說明該方對肥胖患者有療效顯著。防風(fēng)通圣散老藥新用，為臨床PCOS的治療提供了一種可能性。

本研究改良了防風(fēng)通圣散的藥物劑量配比，通過建立PCOS大鼠模型，研究改良后的防風(fēng)通圣散對大鼠血清LH、FSH、血清睪酮(testone，T)的影響以及其對卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響，探討本方改善PCOS患者性激素和排卵狀況的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性SD大鼠21日齡36只，體重200～280 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2016-0011。

1.2 藥品與試劑

防風(fēng)通圣散由防風(fēng)、川芎、當(dāng)歸、芍藥、麻黃、連翹、芒硝、生甘草、薄荷葉各10 g，滑石30 g，黃芩、桔梗、石膏各15g，大黃、荊芥、白術(shù)、梔子各3 g17味中藥組成，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒室按工藝流程煎制配成顆粒(單號：01169)，將配方顆粒融于80℃水中，含生藥量為1.8 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩Ｗ⑸溆萌私q毛膜促性腺激素：北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥劑科。丙酸睪酮：MCE生命科學(xué)試劑服務(wù)商，批號：HY-B1269。血清LH、FSH、T試劑盒：天津協(xié)和醫(yī)藥科技集團有限公司，批號分別為：RA10201、RA10202、RA10206。HE染色試劑盒：Solarbio，批號：G1120。1%羧甲基纖維素鈉溶液：Coolaber，批號：C9230。

1.3 模型制備與分組

目前，國內(nèi)外建立PCOS大鼠模型方法主要有以下幾種：雄激素聯(lián)合胰島素造模法、胰島素聯(lián)合HCG造模法、芳香花酶抑制劑造模法、雄激素造模法、胰島素類造模法、孕激素聯(lián)合HCG造模法、雄激素聯(lián)合HCG造模法等[10]。本實驗采用 Beloosesky造模法[11],即大鼠背部皮下注射丙酸睪酮及人絨毛膜促性腺激素。將21日齡的雌性SD大鼠36只，適應(yīng)性常規(guī)飼養(yǎng)(室溫保持在20℃左右，濕度 65±5%，食物飲水充足，環(huán)境安靜) 3天后，將大鼠分為空白組12只和PCOS組24只，PCOS組24只于23日齡起頸背部皮下注射丙酸睪酮(1.25 mg/只，一日1次)及絨促性腺素(1.5 IU/只，早晚各一次)，持續(xù) 5 周。空白組12只每日皮下注射橄欖油(0.05 mL/只，一日1次)及生理鹽水(0.1 mL/只，早晚各1次)，持續(xù)5周。

造模最后10日，大鼠陰道脫落細胞學(xué)檢查，模型組均失去完整動情周期?？瞻捉M隨機取2只、PCOS組隨機取4只進行腹主動脈采血，離心取血清，用睪酮放免試劑盒檢測T，PCOS組較正常組明顯升高。揭示造模成功。

1.4 給藥方法

隨機將造模成功的20只大鼠分為：模型組10只，中藥組10只；并將空白組10只另成1組，共分為3組?？瞻捉M等體積 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，模型組等體積 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，中藥組：按18 g/(kg·d)給藥，約等于成人每公斤體重用藥量6倍。三組灌胃均1次/天，連續(xù)21天。灌胃治療期間，各組大鼠均正常飼養(yǎng)，每周稱重一次。

1.5 檢測項目及方法

造模最后一天禁食過夜。各組大鼠于最后一次灌胃后第2天以10%的水合氯醛(0.33 mL/100 g)麻醉。

(1)血清激素水平測定：麻醉后，腹主動脈取血后采血5 mL，按 1.2×106rpm/分鐘速度下離心30分鐘，吸取上清液，分裝置于-20℃冰箱中備用。用放射免疫法檢測血清T、LH、FSH水平，并計算LH/FSH比值。

(2)卵巢形態(tài)學(xué)觀察：根據(jù)陰道涂片結(jié)果，動情間期內(nèi)大鼠麻醉后，腹主動脈取血后大鼠斷頸處死，卵巢組織用4%多聚甲醛固定，各級酒精脫水，石蠟包埋，卵巢切片(每張切片厚約5 μM)，HE 染色，在光鏡下觀察比較各組間卵巢形態(tài)學(xué)(顆粒細胞、卵泡和黃體)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FSH、LH、T、LH/FSH水平比較

藥物處理第22天，中藥組LH水平、LH/FSH水平、T水平經(jīng)分析均低于模型組(P<0.05)，中藥組FSH水平較模型組無明顯差異；中藥組T水平低于空白組(P<0.05)，中藥組FSH水平、LH、LH/FSH水平、T水平較空白組無明顯差異；空白組LH水平、LH/FSH水平、T水平均低于模型組(P<0.05)，空白組FSH水平較模型組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠FSH、LH、T及LH/FSH水平比較

2.2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)比較

空白組卵巢色鮮紅，體積較小，組織表面相對光滑。模型組卵巢表面顏色較空白組而言相對蒼白，體積偏大。中藥組卵巢顏色較空白組而言略蒼白，但較模型組而言則相對紅潤，體積與模型組相近。

光鏡下空白組見黃體和處于不同發(fā)育階段的多個卵泡，卵泡顆粒細胞為9～16層，排列整齊，卵泡內(nèi)可見放射冠以及卵母細胞(見圖1A、B)；模型組見黃體和多個囊性擴張的卵泡，卵泡體積增大，呈串狀，卵泡中放射冠或卵母細胞消失，顆粒細胞為2～4層，排列疏松(見圖1C、D)；中藥組黃體及處于不同發(fā)育階段的卵泡數(shù)量介于對照組和模型組之間，部分卵泡內(nèi)可見放射冠以及卵母細胞，顆粒細胞層為8～10層，排列緊密(見圖1E、F)。

3 討論

中醫(yī)方面，PCOS并無對應(yīng)的病名，多歸為“無子” “閉經(jīng)”等疾病范疇。傅山《女科仙方·卷二》曰：“且肥胖之婦，內(nèi)肉必滿，遮子宮，不能受精?！敝斓は凇兜は姆ā分性唬骸叭羰欠适D人，享受其厚，態(tài)于酒食之人，經(jīng)水不調(diào)，不能成胎，謂之軀脂滿溢，閉塞子宮，宜行濕燥痰”，以及“痰積久聚多，隨脾胃之氣以四溢，則流溢于胃腸之外，軀殼之中，經(jīng)絡(luò)為之奎塞，皮肉為之麻木，甚至結(jié)成窠囊，牢不可破，其患因不一矣”。丹溪文中提出的“痰夾於血，逆成窠囊”之“窠囊”即似多囊卵巢之改變?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者對于多囊卵巢綜合征的病因病機尚未形成統(tǒng)一的定論。國醫(yī)大師柴嵩巖教授認為，本病病機以脾腎不足、濕濁結(jié)聚(胞絡(luò))為主[12]。

注：A.空白組(×100)；B.空白組(×400)；C.模型組(×100)；D.模型組(×400)；E.中藥組(×100)；F.中藥組(×400)。

防風(fēng)通圣散出自于《黃帝素問宣明論方》卷三，由防風(fēng)、大黃、白術(shù)、竹茹、茯苓、川芎、當(dāng)歸、麻黃、黃芩、梔子、白芍等17味中藥組成，是解表、清熱、攻下三者并用之方，宣通氣血、上下分消、表里交治，于散瀉之中，寓溫養(yǎng)之意，其汗不傷表，下不傷里；主治外感風(fēng)邪，內(nèi)有蘊熱，表里皆實之證。

3.1 糖脂代謝方面

現(xiàn)代藥理學(xué)證實，防風(fēng)通圣散對于體脂、血糖有顯著的調(diào)節(jié)作用[13]，已經(jīng)在治療肥胖癥方面得到廣泛應(yīng)用[14]，同時治療面部痤瘡[15]等疾病同樣有顯著療效。PCOS患者,超過50%伴有肥胖或超重[16]，存在糖代謝和脂代謝的異常。中醫(yī)學(xué)認為，脾胃功能運化失調(diào)是肥胖的病理基礎(chǔ)。肥胖癥多于外感濕邪，內(nèi)蘊于脾；或恣食肥甘，傷及脾土，水濕內(nèi)停，濕聚生痰，痰濁內(nèi)停，久而化熱有關(guān)。防風(fēng)通圣散降低體脂、調(diào)節(jié)血糖，在治療肥胖、痤瘡等疾病的臨床和實驗成功案例為治療PCOS提出了一個新的思路。此方配以化痰和血諸藥加強健脾利濕，祛痰化瘀之功，協(xié)同治療伴有代謝綜合征肥胖型PCOS患者，為老藥新用，療效顯著。

3.2 腸道代謝方面

PCOS的發(fā)病，目前的西醫(yī)研究可大致分為以下幾類：易感基因、炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子κB、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激等[17]。近年來，越來越多的研究人員將研究重點放在了腸道菌群上，大量研究證實，腸道菌群嚴重影響了PCOS的發(fā)生和發(fā)展[18]。而這，與部分中醫(yī)醫(yī)家治療婦人月經(jīng)病的 “二陽致病”理論[19]不謀而合。具體來講，二陽指的是手陽明大腸經(jīng)和足陽明胃經(jīng)，手陽明大腸經(jīng)與肺經(jīng)相表里，為傳導(dǎo)之官化物出焉，同時又可通調(diào)腹部氣機，若傳導(dǎo)不暢,腹氣不通，濁熱積聚而便秘，陽明腑實，大便秘結(jié)，腹氣不通，亦致胃不受納，二陽積熱進一步加深而成惡性循環(huán)，最終影響氣血的化生，致沖任的失養(yǎng)，進而引發(fā)月經(jīng)的失調(diào)。有研究證實，防風(fēng)通圣散在治療便秘方面也取得了顯著的療效[20]。雖PCOS患者合并表證比例不高[21]，但其治療過程中需同時配以解表走上藥物，以奏“提壺揭蓋”之功。此方開玄府，利水道，在攻下清熱的同時，上下分消，汗不傷表，下不傷里，正對應(yīng)于PCOS本虛標實的病理特征。在PCOS患者中應(yīng)用防風(fēng)通圣散，就是取其通腑泄熱之功。

3.3 實驗結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，給予PCOS大鼠中藥處理第22天，中藥組LH水平、LH/FSH水平、T水平低于PCOS模型組(P<0.05),中藥組T水平低于空白組(P<0.05)，中藥組FSH水平、LH水平、LH/FSH水平與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與PCOS模型組比較，中藥組大鼠發(fā)育中卵泡和黃體數(shù)量略有增加，囊性擴張卵泡明顯減少，顆粒細胞層增厚，排列較緊密。這說明防風(fēng)通圣散可明顯降低PCOS大鼠的T水平，對改善PCOS大鼠LH水平、FSH水平以及LH/FSH水平有明顯的影響，并可有效改善PCOS大鼠的卵巢卵泡生長狀態(tài)，這在一定程度上證明了防風(fēng)通圣散對于PCOS大鼠有治療效果。結(jié)合防風(fēng)通圣散治療糖脂代謝異常、肥胖癥、便秘、痤瘡等病證的突出療效，其治療肥胖型PCOS患者可有殊途同歸之妙。但本研究中藥組大鼠僅使用中藥灌胃治療，未設(shè)立采用其他方式治療的對照組，僅討論了防風(fēng)通圣散對PCOS大鼠血清及卵巢組織中產(chǎn)生的變化，未深入研究其變化機制，同時尚缺少臨床相關(guān)研究。因此，防風(fēng)通圣散在PCOS治療中的作用及機制需進一步研究證實，可能與調(diào)節(jié)糖脂代謝和調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。