RNA m6A甲基化參與腎臟纖維化進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究

陳靜 張函 顧玉露 丁小強(qiáng) 章曉燕

200032 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。RNA甲基化主要發(fā)生在N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)位點(diǎn)[1]。m6A修飾在基因表達(dá)調(diào)控、mRNA剪接、RNA穩(wěn)定性等方面扮演重要角色[2]。m6A修飾主要由甲基化酶(writers)、去甲基化酶(erasers)和識別蛋白(readers)所調(diào)控，參與RNA剪接、出入核、蛋白質(zhì)翻譯及降解等多種生物學(xué)過程[3-5]。甲基化RNA免疫共沉淀結(jié)合高通量測序(Methylated RNA Immunoprecipitation with next generation sequencing，MeRIP-seq)[5]，使用N6-甲基腺嘌呤抗體富集高甲基化的RNA片段，并通過結(jié)合高通量測序，能夠高效精確的在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測發(fā)生甲基化的RNA區(qū)域。通過使用這一技術(shù)，我們可以比較不同細(xì)胞、組織、樣本間的RNA甲基化修飾模式的差異，發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵生物學(xué)改變[6-7]。

近年研究表明，m6A在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。但在腎臟纖維化發(fā)生過程中m6A變化如何、扮演什么角色？目前還不明確。本研究基于MeRIP-seq數(shù)據(jù)庫解析腎臟纖維化發(fā)生過程中RNA m6A的變化，篩選出差異基因和關(guān)鍵通路，初步確定參與調(diào)控RNA m6A的關(guān)鍵甲基酶，為腎臟纖維化的RNA甲基化機(jī)制研究提供重要理論參考。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物與試劑

1.動物 健康的6～8周齡雄性小鼠(種系C57BL/6)，重量19～24 g，購自上海杰思捷生物科技有限公司，自由進(jìn)食飲水。

2.試劑 PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司)、RNAiso Plus(Trizol)(美國Thermo公司)、SYBR Green PCR試劑盒(日本Takara公司)

二、方法

1.動物模型與實(shí)驗(yàn)分組 C57BL/6小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d。采用隨機(jī)數(shù)字表法分成2組：假手術(shù)組(Sham組)(n=6)、腎臟纖維化組(UUO組)(n=6)。UUO組經(jīng)小鼠背部右側(cè)切口將小鼠右側(cè)輸尿管游離、結(jié)扎并剪斷，Sham組僅游離右側(cè)輸尿管不結(jié)扎。造模7 d后收集腎組織標(biāo)本。

2.mRNA樣品制備 利用Trizol法提取總RNA并檢測RNA的濃度和純度。使用rRNA試劑盒去除rRNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA完整性。然后高頻超聲儀隨機(jī)打斷RNA樣本，將片段化的RNA與m6A抗體加入IPP緩沖液中，4 ℃孵育2 h。進(jìn)一步反應(yīng)混合物用protein A磁珠在4 ℃環(huán)境下免疫沉淀2 h。之后用游離的m6A腺苷類似物洗脫磁珠上結(jié)合的mRNA。洗脫的mRNA進(jìn)一步通過Trizol試劑(Thermo Fisher)進(jìn)行抽提。抽提純化的RNA進(jìn)行質(zhì)譜檢測，并進(jìn)一步MeRIP-seq測序(上海云序生物公司)。

3.RT-PCR檢測 根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，選取目前已知m6A關(guān)鍵調(diào)控酶甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(methyltransferase-like protein,METTL)3、METTL4、METTL14、肥胖相關(guān)基因(fat mess and obesity us sociated,FTO)、ALKBH5基因進(jìn)行RT-PCR檢測。所用引物均由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，具體引物序列見表1，其中18s作為內(nèi)參對照，采用2-ΔΔct分析方法計(jì)算目的基因的表達(dá)差異。

表1 RT-PCR引物列表

4.免疫組化檢測 使用Abcam公司的METTL14抗體(貨號：ab252562，抗體使用濃度1∶200)，檢測小鼠腎臟組織METTL14的表達(dá)情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有RT-PCR結(jié)果數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，進(jìn)行單因素方差分析。采用Dunnet’s T3法分析組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、質(zhì)譜結(jié)果

首先通過MASSON染色，證實(shí)腎臟纖維化模型造模成功(P<0.05)。我們使用質(zhì)譜法檢測兩組RNA m6A含量變化(由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院提供技術(shù)支持)，發(fā)現(xiàn)UUO組腎臟RNA m6A含量顯著升高(P<0.05)。(圖1)

二、測序結(jié)果

我們使用Ilumina平臺對Sham組和UUO組腎組織樣本RNA m6A進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，UUO處理腎臟差異表達(dá)1.5倍以上的差異甲基化的編碼基因共1 352個(gè)，其中上調(diào)906個(gè)，下調(diào)446個(gè)，包括細(xì)胞連接、炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)分化、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞黏附等相關(guān)的基因。(圖2～3)

三、m6A關(guān)鍵調(diào)控酶的篩選

采用RT-PCR檢測METTL3、METTL4、METTL14、肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity associated，F(xiàn)TO)、ALKBH5基因的表達(dá)差異情況。進(jìn)一步通過免疫組化方法，我們發(fā)現(xiàn)METTL14在腎臟的主要表達(dá)部位為腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核，UUO組腎臟METTL14表達(dá)顯著升高(P<0.05)。由此，我們推測RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14可能是腎臟纖維化過程中m6A的關(guān)鍵調(diào)控酶。(圖4)

討 論

本研究通過高通量測序的方法，研究了RNA m6A修飾在UUO小鼠纖維化腎臟的變化發(fā)現(xiàn)，纖維化腎臟m6A含量顯著升高。我們還初步篩選了引起m6A變化的調(diào)控酶，發(fā)現(xiàn)METTL14在UUO組顯著升高，可能是引起m6A參與腎臟纖維化的關(guān)鍵調(diào)控酶。

m6A甲基化修飾是一種動態(tài)可逆的反應(yīng)，由甲基化酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白共同參與[8-10]。RNA m6A修飾主要由甲基轉(zhuǎn)移酶系催化進(jìn)行，以METTL3和METTL14最為重要。甲基轉(zhuǎn)移酶的主要作用就是催化mRNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾。而去甲基化酶包括FTO和ALKBH5等，它的作用是對已發(fā)生m6A修飾的堿基進(jìn)行去甲基化修飾，使RNA甲基化成為一種可逆的反應(yīng)[8-9]。研究還發(fā)現(xiàn)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(如METT14)和去甲基酶(如FTO)分別作為編碼器和消碼器。m6A的閱讀器可以選擇性地結(jié)合到含有m6A修飾位點(diǎn)的RNA上，從而介導(dǎo)下游基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)。國內(nèi)外越來越多的學(xué)者在胚胎干細(xì)胞的維持和分化、晝夜節(jié)律改變、熱休克反應(yīng)、減數(shù)分裂進(jìn)展和神經(jīng)元功能等方面開展了m6A的深入研究[10]。然而，目前仍有大部分RNA修飾的生物學(xué)作用未被發(fā)現(xiàn)，尤其是m6A甲基化在腎臟纖維化發(fā)生和發(fā)展中的作用。

本研究通過高通量測序的方法，分析了RNA m6A修飾在UUO小鼠纖維化腎臟RNA m6A甲基化差異位點(diǎn)的變化。這些差異化位點(diǎn)基因包括細(xì)胞連接、炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)分化、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞黏附、血管鈣化等，其中差異最顯著的基因Cyclin D1在調(diào)控細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，為本課題后續(xù)的分子機(jī)制研究提供了重要依據(jù)。在本研究中，我們還通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)初步篩選了參與調(diào)控RNA甲基化的關(guān)鍵調(diào)控酶，發(fā)現(xiàn)METTL14可能是引起腎臟纖維化過程中一系列基因表達(dá)改變的關(guān)鍵酶。由此我們推斷METTL14可能是RNA甲基化參與腎臟纖維化的關(guān)鍵調(diào)控酶。結(jié)合目前RNA甲基化的系列研究，我們將圍繞甲基化酶METTL14在腎臟纖維化中的作用開展深入研究。本研究的不足之處，我們只觀察了輸尿管梗阻后7 d的腎組織RNA m6A表達(dá)變化，對于梗阻后RNA m6A的動態(tài)變化過程沒有進(jìn)行觀察，所以不能對其與腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性做出有效的預(yù)測。

RNA表觀遺傳學(xué)已成為表觀遺傳學(xué)中一個(gè)快速發(fā)展的研究熱點(diǎn)，在未來人類疾病的治療方面有很好的發(fā)展前景[11-15]。因此，深入研究和探討RNA甲基化在腎臟纖維化的生物學(xué)作用，將加深我們對腎臟纖維化病理機(jī)制的理解，為臨床診斷和治療提供新思路。