狼瘡腎炎患者腸道菌群變化與臨床病理特征、腎臟遠(yuǎn)期生存的相關(guān)性研究

黃佩瓊 宋巧巧 舒泉

437100 咸寧，湖北科技學(xué)院內(nèi)科教研室(黃佩瓊，舒泉)；437100 咸寧市中心醫(yī)院內(nèi)科(宋巧巧)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是累及全身多個臟器的自身免疫性疾病。狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是最常見的臟器受累表現(xiàn)，同時也是影響SLE預(yù)后、引起終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的重要病因。根據(jù)Zhang等[1]和Maruyama等[2]的研究，Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅴ型LN的腎臟預(yù)后較好，而Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型的病情較重、腎臟預(yù)后較差。因此，研究Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型LN患者腎臟預(yù)后的影響因素對評估病情、指導(dǎo)治療均具有一定意義。

近些年，自身免疫性疾病、慢性腎臟病與腸道菌群紊亂的關(guān)系受到越來越多關(guān)注，國內(nèi)李苗等[3]的研究表明，SLE患者存在腸道菌群紊亂且與多種免疫細(xì)胞因子的異常分泌有關(guān)；國內(nèi)張育彬等[4]的研究表明，慢性腎臟病患者存在腸道菌群紊亂且與多種炎癥細(xì)胞因子的異常分泌有關(guān)。但LN發(fā)病過程中腸道菌群的變化及其與腎臟預(yù)后的關(guān)系尚不明確。因此，本研究將以Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型LN患者為對象，分析腸道菌群變化與臨床病理特征、腎臟遠(yuǎn)期生存的相關(guān)性，旨在闡明腸道菌群紊亂在LN發(fā)病中的作用并為今后治療LN、改善LN預(yù)后提供新思路。

對象與方法

一、研究對象

選擇2017年8月至2018年8月期間在我院診斷為LN的患者作為LN組。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)參照《中國狼瘡腎炎診斷和治療指南》，首次診斷為LN且病理分型為Ⅲ型、Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型[5]；(2)漢族；(3)隨訪時間≥1年；(4)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腎活檢時已經(jīng)達(dá)到ESRD的患者；(2)隨訪資料及臨床病理資料不全。選擇同期在我院診斷為SLE的患者作為SLE組，符合SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]且參照《中國狼瘡腎炎診斷和治療指南》[5]排除腎臟損傷、不符合LN的診斷；選擇同期在我院體檢的健康志愿者作為對照組。LN組共114例，包括男性23例、女性91例，年齡(42.5±10.8)歲；SLE組共80例，包括男性18例、女性62例，年齡(39.2±9.2)歲；對照組共100例，包括男性23例、女性77例，年齡(41.1±11.2)歲。3組間一般資料的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、方法

1.腸道菌群的檢測方法 收集LN組患者的糞便標(biāo)本，采用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用熒光定量PCR試劑盒配置PCR反應(yīng)體系，基因組DNA2 μL、反應(yīng)混合液10 μL、5 μmol/L的上下游引物各0.5 μL、去離子水7 μL。所用引物分別為雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌標(biāo)志基因的特異性引物。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min后95 ℃ 15 s、基因特異性退火溫度(雙歧桿菌52 ℃、乳酸桿菌54 ℃、大腸桿菌60 ℃)30 s、72 ℃ 45 s并重復(fù)40個循環(huán)。得到循環(huán)曲線后計算各樣本中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌的拷貝數(shù)。

2.遠(yuǎn)期腎臟生存的隨訪 采用門診復(fù)查、電話或網(wǎng)絡(luò)回訪等方式進(jìn)行隨訪，終點事件為ESRD，隨訪截止時間為確診LN后1年。采用CKD-EPI公式計算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)，eGFR<15 mL·min-1·(1.73 m2)-1且持續(xù)3個月以上定義為ESRD，未發(fā)生ESRD即為腎臟生存。

3.臨床病理特征的收集 根據(jù)LN患者的病歷資料收集以下臨床病理特征：是否存在面部紅斑、雷諾現(xiàn)象、光過敏、關(guān)節(jié)炎的癥狀，是否合并高血壓，血紅蛋白(hemoglobin，Hb)、白蛋白(albumin，Alb)、血肌酐(Scr)、24h尿蛋白含量，Hb男性<120 g/L、女性<110 g/L為Hb降低，Alb<35 g/L為Alb降低，Scr>106 μmol/L為Scr升高，24 h尿蛋白定量≥3.5 g為大量蛋白尿。病理分型參照ISN/RPS2003分型方案，包括Ⅲ型、Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件錄入數(shù)據(jù)，計量資料以Mean±SD表示、兩組間進(jìn)行t檢驗，多組間進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，影響因素的單因素及多因素分析均采用COX回歸模型分析，預(yù)測價值采用ROC曲線分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LN組、SLE組、對照組糞便中腸道菌群的比較

LN組、SLE組患者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌的含量明顯低于對照組，大腸桿菌的含量明顯高于對照組(P<0.05)；LN組患者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌的含量明顯低于SLE組，大腸桿菌的含量明顯高于SLE組(P<0.05)。(表1)

表1 LN組、SLE組、對照組糞便中腸道菌群的比較(lg copies/g)

二、不同臨床病理特征LN患者糞便中腸道菌群的比較

不同性別、面部紅斑、雷諾現(xiàn)象、光過敏、合并高血壓、Hb、Alb等臨床特征的LN患者，腸道菌群含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；合并關(guān)節(jié)炎、SCr升高、大量蛋白尿、Ⅳ/Ⅳ+Ⅴ型患者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌的含量明顯低于未合并關(guān)節(jié)炎、SCr正常、無大量蛋白尿、Ⅲ/Ⅲ+Ⅴ型患者，大腸桿菌的含量明顯高于未合并關(guān)節(jié)炎、SCr正常、無大量蛋白尿、Ⅲ/Ⅲ+Ⅴ型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(表2)

三、LN患者遠(yuǎn)期腎臟生存影響因素的單因素COX分析

以LN患者是否發(fā)生ESRD為應(yīng)變量，以腸道菌群及臨床病理特征為自變量，在COX模型中進(jìn)行單因素分析，性別、合并高血壓、LN病程、SCr、大量蛋白尿、病理類型、雙歧桿菌含量、乳酸桿菌含量、大腸桿菌含量是ESRD的影響因素(P<0.05)，Hb、Alb與ESRD的發(fā)生無明顯關(guān)系(P>0.05)。(表3)

表2 不同臨床病理特征LN患者糞便中腸道菌群的比較(lg copies/g)

表3 LN患者遠(yuǎn)期腎臟生存影響因素的單因素COX分析

四、LN患者遠(yuǎn)期腎臟生存影響因素的多因素COX分析

以LN患者是否發(fā)生ESRD為應(yīng)變量，以單因素分析有統(tǒng)計學(xué)差異的因素性別、合并高血壓、LN病程、SCr、大量蛋白尿、病理類型、雙歧桿菌含量、乳酸桿菌含量、大腸桿菌含量為自變量，在COX模型中進(jìn)行多因素分析，LN病程、SCr、病理類型、雙歧桿菌含量是ESRD的影響因素(P<0.05)。(表4)

表4 LN患者遠(yuǎn)期腎臟生存影響因素的多因素COX分析

五、LN患者糞便中雙歧桿菌含量預(yù)測遠(yuǎn)期腎臟生存的ROC曲線分析

繪制LN患者糞便中雙歧桿菌含量預(yù)測遠(yuǎn)期腎臟生存的ROC曲線，曲線下面積為0.6641(95%CI：0.5367～0.7916，P=0.015)，根據(jù)約登指數(shù)最大值確定最佳截點為4.598，該最佳截點預(yù)測LN患者遠(yuǎn)期腎臟生存的靈敏度和特異性分別為67.03%和65.22%。(圖1)

討 論

LN是SLE最常見的并發(fā)癥，也是造成ESRD常見的病因之一。根據(jù)ISN/RPS2003病理分型方案，LN共分為6個病理類型，其中Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅴ型的預(yù)后較好，Ⅵ型已經(jīng)發(fā)展為終末期腎??；而Ⅲ型、Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型的腎臟預(yù)后較差，同時也是目前臨床上研究LN腎臟預(yù)后關(guān)注的重點。目前，研究LN患者腎臟預(yù)后的影響因素是腎臟病領(lǐng)域的研究熱點，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的影響因素不僅有助于指導(dǎo)診療方案的制定，也有助于闡明LN的發(fā)病機(jī)制并尋找新的治療靶點。

腸道菌群的生理功能及在多種病理生理過程中的作用受到越來越多關(guān)注，多項研究證實在SLE、系統(tǒng)性硬化癥、自身免疫性肝病、干燥綜合征等自身免疫性疾病的發(fā)病過程中，均存在腸道菌群的紊亂[3，7-10]；相關(guān)動物實驗證實，糞菌移植能夠調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠、潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的腸道菌群并改善免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)[11-12]，提示腸道菌群紊亂參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)的調(diào)控并在自身免疫性疾病的發(fā)病中起重要作用。另有慢性腎臟病及急性腎損害的研究表明，腸道菌群的紊亂與腎功能損傷有關(guān)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)是可能的機(jī)制[13-14]?；谝陨夏c道菌群紊亂與SLE、腎功能損傷的研究結(jié)果，本研究分析了腸道菌群紊亂在LN發(fā)病中的作用，LN患者和SLE患者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌的含量明顯減少，大腸桿菌的含量明顯增加且LN患者腸道菌群的變化較SLE患者更為顯著。上述SLE患者腸道菌群的變化結(jié)果與既往李苗等[3]的研究結(jié)果一致，LN患者腸道菌群的變化較SLE患者加重的結(jié)果表明腸道菌群紊亂可能參與了LN的發(fā)生。

LN的預(yù)后與病理分型有關(guān)，Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅴ型LN的腎臟預(yù)后較好，而Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型LN的腎臟預(yù)后較差。國內(nèi)楊靜等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型與Ⅲ+Ⅴ型LN比較、Ⅳ型與Ⅳ+Ⅴ型LN比較，腎臟生存情況并無差異，提示在Ⅲ型或Ⅳ型LN的基礎(chǔ)上發(fā)生膜性腎炎的病理改變不影響LN患者的腎臟預(yù)后?；诖?，本研究未進(jìn)行Ⅲ型與Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ型與Ⅳ+Ⅴ型的比較，而是按照病理特征分為Ⅲ/Ⅲ+Ⅴ型及Ⅳ/Ⅳ+Ⅴ型，通過分析不同病理特征LN患者腸道菌群的差異可知：合并關(guān)節(jié)炎、SCr升高、大量蛋白尿、Ⅳ/Ⅳ+Ⅴ型病理分型患者的腸道菌群紊亂更顯著，表明LN患者腸道菌群的紊亂與部分臨床病理特征的惡化有關(guān)，腸道菌群參與了LN病情的發(fā)生變化。

Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型LN的腎臟預(yù)后差、腎臟遠(yuǎn)期生存情況不理想，部分患者會迅速發(fā)展為ESRD。楊靜等[15]的研究通過隨訪ESRD的發(fā)生情況來評價LN患者的腎臟預(yù)后，分析相關(guān)的影響因素發(fā)現(xiàn)：LN病程、平均動脈壓、SCr、病理類型等臨床病理因素均是LN患者腎臟預(yù)后的影響因素。本研究采用相同的方法隨訪了患者腎臟生存情況，將臨床病理因素及腸道菌群共同納入COX模型，分析遠(yuǎn)期腎臟生存的影響因素，臨床病理特征與ESRD的關(guān)系與楊靜的研究一致，即LN病程、SCr、病理類型是ESRD的影響因素，同時本研究還發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌含量也影響ESRD的發(fā)生，雙歧桿菌含量降低是ESRD的危險因素。進(jìn)一步通過ROC曲線驗證了雙歧桿菌含量與ESRD的關(guān)系可知：糞便中雙歧桿菌含量的減少對LN患者發(fā)生ESRD具有預(yù)測價值。以上COX模型分析及ROC曲線分析結(jié)果均表明腸道菌群中的雙歧桿菌在LN的病情發(fā)展變化中起關(guān)鍵作用，與ESRD的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，LN患者存在腸道菌群紊亂且與部分臨床病理特征相關(guān)，腸道菌群中雙歧桿菌的減少與ESRD的發(fā)生有關(guān)、對ESRD具有預(yù)測價值，未來補(bǔ)充雙歧桿菌可能成為延緩LN病情發(fā)展及ESRD發(fā)生的治療手段。但本研究對腎臟生存的隨訪時間較短，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行隨訪并收集資料，進(jìn)而闡明腸道菌群紊亂在腎臟遠(yuǎn)期生存中所起的作用。